IRE-1-JNK通路在应力介导的成肌细胞凋亡中的作用及其机制

发布时间：2019-01-24 09:39

【摘要】：目的：功能矫形,是矫治处于生长发育期中的青少年和儿童错合畸形的一种重要的手段。功能矫治器通过咬合重建引发一系列的神经肌肉收缩力的变化,该力传递到口腔周围的软硬组织,促进软硬组织的适应性变化,刺激颌骨和牙周组织的生长改建,改变颌骨的自然生长潜力,从而达到错合畸形的目的。只有面颌部肌肉改建与口腔周围软硬组织相协调,功能矫形的效果才能稳定,因此,探讨面颌部肌肉适应性改建机制对于阐明功能矫形的原理具有指导意义。研究面颌部肌肉组织的适应性改建的机制,须从细胞入手。成肌细胞是肌肉组织的干细胞,成肌细胞的增殖、分化和凋亡等生物学行为在面颌部肌肉的适应性改建中发挥着至关重要的作用,而成肌细胞的凋亡是当今研究的热点。经典的细胞凋亡的途径有两条：包括外源性的死亡活化受体途径和内源性的线粒体损伤途径,而内质网途径是近年来逐渐被人们揭示的一条新的凋亡途径。当细胞内外环境的改变引起内质网内未折叠或错误折叠蛋白质聚集,钙稳态失衡,从而导致的内质网功能紊乱的状态,发生内质网应激。为了减轻内质网应激,真核细胞激活一些列自身保护机制,称为未折叠蛋白反应；但持续的或者过强的内质网应激,会导致细胞发生凋亡。本研究建立在成功构建成肌细胞体外培养力学刺激模型的基础上,旨在探索周期性应力引起成肌细胞凋亡的规律,探讨内质网应激IRE-1-JNK信号通路在该过程中的作用及其机制；从而获得应力调控成肌细胞凋亡的信息,为功能矫形治疗中合理使用应力以及阐明面颌部肌肉的适应性改建的机理提供的理论依据。方法：体外培养L6大鼠成肌细胞,应用多通道应力加载装置对分别对成肌细胞加载Oh、1h、2h、6h、12h和24h的周期性张应力(频率为10cycles/min,拉伸变形率为15%),构建成肌细胞-体外培养力学刺激模型,对照组为不加力组(0h),对照组与实验组其他培养条件相同。应用Hochest33258染色观察不同应力加载时间对成肌细胞凋亡的影响；应用Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测成肌细胞的凋亡率；采用Real Time PCR检测内质网应激相关因子Chop、TRAF2、ASK1和JNK mRNA的表达变化；应用Western blotting检测JNK蛋白的表达变化；加入IRE-1特异性抑制剂STF-083010后检测TRAF2、ASK1和JNK mRNA和JNK蛋白的表达变化,以明确IRE-1-JNK通路在应力介导成肌细胞凋亡中的作用及机制,采用SPSS17.0对实验数据进行分析。结果： 1、Hochest33258染色、Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测成肌细胞凋亡率,结果一致表明周期性张应力(频率为10cycles/min,拉伸变形率为15%)可诱导体外培养的成肌细胞发生凋亡,并且凋亡率随应力加载时间的延长而呈一致上升趋势,且在24h达峰值。 2、Real Time PCR结果显示：CHOP、TRAF2、ASK1mRNA表达量随应力加载时间的延长而逐渐上升,并在24h达最高值,差异有统计学意义(P0.05); JNK mRNA的表达量在0-2h逐渐上升后逐渐下降,随后又逐渐上升在24h达最高值,差异有统计学意义(P0.05)。 3、Western blotting结果显示：JNK蛋白随着应力加载时间的延长,先升高,其后略有下降,并于24h达到最高值,差异有统计学意义(P0.05)。 4、加入大鼠IRE-1特异性抑制剂STF-083010后,Real Time PCR检测TRAF2、ASK1JNK mRNA表达,结果显示：TRAF2、ASK1表达量均明显减少,差异有统计学意义(P0.05),与对照组(0h不加抑制剂组)表达量的差别无统计学差异；JNK表达量与不加抑制剂组明显降低,但仍高于对照组与对照组,差异有统计学意义(P0.05)。 5、加入抑制剂后,Western blotting检测JNK蛋白表达变化,结果显示,随应力加载时间的延长,JNK蛋白表达量与不加抑制剂组比较其表达量明显降低,但仍高于对照组(0h不加抑制剂组),差异有统计学意义(p0.05),但是加抑制剂后各组之间的差别无统计学意义。结论： 1、周期性张应力(频率为10cycles/min,拉伸变形率为15%)可诱导成肌细胞的凋亡,并且随着应力加载时间的延长,凋亡率随着应力加载时间的延长而升高。 2、CHOP、TRAF2、ASK1、JNK mRNA及JNK蛋白的表达量升高,提示内质网相关的凋亡途径参与了应力介导的成肌细胞的凋亡 3、加入IRE-1抑制剂后,TRAF2、ASK1、JNK mRNA及JNK蛋白表达量均明显降低,提示IRE-1-JNK通路参与了应力介导的成肌细胞凋亡。 4、加入抑制剂前后JNK mRNA及蛋白的表达变化提示,JNK除了可由IRE-1激活外,还可由其他途径激活,其具体机制尚有待继续深入研究。
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【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R783.5

【参考文献】