增龄因素影响下牙周膜干细胞生物学行为变化及Wnt通路对其调控机制的研究

发布时间：2019-03-24 16:21

【摘要】：背景:既往正畸治疗主要以青少年为主,近年来,随着社会经济的不断发展和人民生活水平的提高,公众对口腔健康及面部审美的要求日益增强,临床上成人正畸矫治的比例逐年增加。但是与青少年相比,成人正畸治疗时间长,且治疗效果也不如青少年完善。牙周组织的改建是影响正畸疗效与疗程快慢的关键问题,牙周膜连接牙齿与牙槽骨,在牙周组织改建的过程中起到桥梁作用。牙周膜细胞是正畸矫治力的直接效应细胞,在牙周组织改建过程中发挥重要作用。当矫治力传递到牙周膜上时,牙周膜中的前体细胞或牙周膜干细胞在张力侧分化为成骨细胞,引起骨沉积;在压力侧分化为破骨细胞,引起骨吸收。牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells, PDLSC)是来源于牙周膜组织的成体干细胞,可来源于牙根部或牙槽窝内的牙周膜组织,与牙周组织关系密切。2004年,Seo等利用单细胞克隆技术首次证实了牙周膜干细胞(PDLSC)的存在,研究证实其具有良好的增殖能力、自我更新能力和多向分化能力,在特定的诱导条件下可向不同细胞进行分化,其不仅在牙周病的治疗、种植体周围软硬组织缺损的修复过程中发挥重要作用,同时参与正畸牙齿移动中的骨改建,在正畸牙齿移动过程中发挥重要作用。机械力在正畸的牙槽骨改建过程中发挥重要作用,然而年龄因素也是影响正畸过程中牙周组织改建的重要因素。随着年龄的增长,干细胞的功能受到一定影响,其平衡遭到破坏。机体增龄的过程中,间充质干细胞的自我调节机制发生改变,从而使其某些生物学性状不再稳定,主要表现为自身抵抗力的降低及其对外界环境刺激的反应能力的降低,从而诱发疾病的易感性,最终引起死亡,因而增龄可能会引起机体内干细胞生物学特性发生变化,从而影响最终的正畸治疗效果,但其影响机制目前尚不明确。Wnt信号通路广泛存在于生物体中,在胚胎和多种器官的发育过程中发挥重要的信号转导作用,调控了多种生命过程,如细胞的增殖、分化、凋亡、免疫、应激等。研究发现Wnt信号通路在牙周膜的发育过程中发挥重要作用,同时可调控PDLSC的增殖与分化。近年来的研究提示,Wnt信号通路与干细胞的增龄变化有密切关系,有学者发现Wnt/ β -catenin信号通路对骨髓间充质干细胞的衰老发挥重要调控作用,也有研究表明Wnt/β -catenin信号通路可以通过促进细胞产生ROS进而诱导间充质干细胞的衰老,然而目前关于PDLSC增龄的调控机制目前尚无相关报道。目的:获取不同年龄阶段健康离体牙,分离培养PDLSC,观察增龄因素对PDLSC的生物学特性的影响,并探索Wnt信号通路与增龄过程中PDLSC成骨分化能力的关系。方法:第一部分:分别获取不同年龄组患者的健康离体牙(3组病例资料情况:A组,年龄18-20岁,男4例,女4例:B组,年龄30-35岁,男4例,女4例:C组,年龄45以上岁,男4例,女4例),分离培养获得牙周膜干细胞(PDLSC),对其生物学特性进行对比分析。通过MTT检测三组PDLSC增殖能力的差异;检测三组PDLSC的克隆形成能力;对其进行成骨、成脂诱导分化实验,并用茜素红染色评价其成骨分化能力,油红O染色评价其成脂分化能力;通过流式细胞仪检测细胞周期和其凋亡,并通过SA-β-gal染色分析细胞衰老程度差异。第二部分:牙周膜干细胞具有多向分化能力,为了明确增龄因素对PDLSC成骨分化能力的影响,对三个实验组的PDLSC均进行成骨诱导,成骨诱导7d后对其进行ALP染色,同时提取RNA和蛋白。采用实时定量PCR检测其成骨关键基因ALP、Runx-2和col-1的表达,并用Western blot定量比较成骨诱导前后成骨相关蛋白ALP、OCN的表达。第三部分:为了检测增龄条件下矛周膜干细胞与Wnt信号通路的关系,对三个实验组的PDLSC均进行成骨诱导,成骨诱导7d后提取RNA和蛋白。采用实时定量PCR检测其Wnt相关基因Wnt/ -catenin、P38和NLK的表达,并用Western blot定量比较成骨诱导前后Wnt关键蛋白Wnt/β -catenin、P38和NLK的表达。结果:第一部分:增龄因素影响下PDLSC生物学特性的变化1、不同年龄阶段的供体中都能分离出PDLSC:2、三个实验组PDLSC的克隆形成率从年轻组到增龄组有所下降,分别为36.67%,26.67%, 9.33%,有统计学差异;3、MTT增殖检测显示三个实验组均有较强的增殖能力,从第五天开始,三个实验组的增殖能力出现差异,差异有统计学意义:PDLSC细胞周期检测S+G2/M期的比例从年轻组到增龄组有所下降,分别为38.73%,29.88%,18.25%;4、茜素红染色显示三个实验组PDLSC成骨诱导21d后均可见矿化结节形成,但矿化结节大小和数量从年轻组(A组)到增龄组(C组)逐渐减少,油红O染色显示三个实验组PDLSC成脂诱导14d后均可见脂滴形成,但脂滴数量与从A组到C组增加;5、从年轻组到增龄组,三个实验组PDLSC凋亡早期与晚期的比例有所上升,分别为1.57%, 4.56%, 5.84%;6、SA-β-gal染色显示,从年轻组到增龄组阳性染色细胞数目有所增加,其染色面积分别为4.14%,16.39%,50.38%,有统计学差异。第二部分:增龄因素对PDLSC成骨分化能力的影响1、三个实验组的PDLSC成骨诱导后ALP染色均可染色,从年轻组到增龄组其染色面积减少。2、实时定量PCR检测提示成骨诱导后成骨关键基因ALP、col-1、Runx-2表达从年轻组到增龄组有所下降。3、Western blot进一步证实成骨诱导后,成骨关键蛋白ALP、OCN表达均较对照组明显升高,但成骨诱导后从年轻组到增龄组其表达的灰度值下降。第三部分:增龄因素影响下Wnt通路调控PDLSC的成骨分化1、实时定量PCR检测提示,三个实验组经典Wnt/β -catenin的表达水平从年轻组到增龄组有所上升,成骨诱导后其表达均增强,从年轻组到增龄组仍呈上升趋势。2、实时定量PCR检测提示三个实验组NLK表达水平从年轻组到增龄组有所上升,成骨诱导后其表达均下降。3、实时定量PCR检测提示P38 Mark水平从年轻组到增龄组有所下降,成骨诱导后其表达均下降。4、Western进一步证实成骨诱导后经典Wnt/ β -catenin表达水平从年轻组到增龄组有所上升,成骨诱导后其表达均增强,从年轻组到增龄组仍呈上升趋势。结论:1、随着年龄的增长,PDLSC的增殖能力下降、成脂分化能力增强,凋亡水平升高。2、随着年龄的增长,PDLSC的成骨分化能力下降。3、随着年龄的增长,经典Wnt信号通路的核心蛋白β-catenin表达增强
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【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R783.5

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