贝尼地平对成骨细胞功能影响及其纳米载药系统的生物应用

发布时间：2019-04-10 07:05

【摘要】：高血压是中老年人群中的常见疾病，有调查显示中国成年人中高血压患病率接近20%，这一比例随着我国老龄化社会的进程而不断提高。口腔种植及修复的患者当中，中老年人所占比例高，因此高血压患者的比重就更大。钙拮抗剂是目前治疗高血压疾病的常用药物，包括使用历史最长、最普遍的硝苯地平（心痛定），以及氨氯地平（络活喜）等。然而此类药物对于常年用药患者的骨质有何影响，是否会减低骨密度，进而影响患者接受口腔种植及修复治疗的疗效；或是能够促进骨质的生成，对骨质疏松具有防治作用，这些都是值得关注并探究的问题。贝尼地平为第二代二氢吡啶类钙拮抗药，常用于治疗高血压和心绞痛。有研究显示贝尼地平能够促进成骨细胞的分化，但未见对其促进成骨作用的系统性研究。本研究通过一系列体外实验评价贝尼地平对于成骨细胞功能的影响，以期望发现贝尼地平除常规降压作用外，还具有促进骨质生成这一新的临床药用价值。同时本实验制备了硅酸镁纳米球，并首次以其作为药物载体，建立载贝尼地平药物的硅酸镁纳米载药系统，以提升贝尼地平促进成骨的作用效果，并增强其作为局部治疗药物的稳定性，为贝尼地平促进成骨作用的临床应用提供理论依据。此外本实验中还首次以硅酸镁纳米球作为化疗药物载体，制备载阿霉素药物的硅酸镁纳米载药系统，评价其载药性能及药物释放特性，并通过体外及体内实验探究其抑制肿瘤的作用效果，为该纳米载药系统的临床应用提供理论基础。 1.贝尼地平对成骨细胞功能的影响目的：采用MC3T3-E1Subclone14小鼠前成骨细胞系作为成骨细胞模型，系统性评价贝尼地平在体外对成骨细胞功能的影响。方法：配制浓度为10-10~10-4mol/L的贝尼地平（benidipine，BD）梯度药物溶液，通过MTT法检测BD对MC3T3-E1细胞增殖活性的影响，筛选促进该细胞增殖的药物浓度区间进行后续实验。通过ALP活性水平及茜素红染色检测BD对MC3T3-E1细胞分化活性及矿化能力的影响，并通过RT-PCR及Western Blot检测BD对于MC3T3-E1细胞BMP2、OCN及Runx2mRNA和蛋白表达水平的影响。结果：BD浓度为10-5~10-4mol/L时对细胞增殖具有抑制作用，在较低浓度10-10mol/L时对细胞的增殖无显著影响，而浓度区间于10-9~10-6mol/L时该药物能够显著促进细胞的增殖，因此筛选此浓度区间进行后续实验。浓度区间于10-9~10-6mol/L的BD能够提高MC3T3-E1细胞ALP的活性水平及矿化能力，其中浓度为10-7mol/L时作用效果最为显著。同时此浓度区间的BD也能够上调MC3T3-E1细胞BMP2、OCN及Runx2mRNA和蛋白的表达水平。结论：浓度为10-9~10-6mol/L的BD能够促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化及矿化，并能上调该细胞BMP2、OCN及Runx2mRNA和蛋白的表达水平。其中浓度为10-7mol/L的BD体外促进成骨的作用效果最为显著。 2.硅酸镁纳米球的制备及其生物相容性的研究目的：制备硅酸镁纳米球（magnesium silicate nanospheres，MSNs），检测该纳米材料的形貌结构特征，并通过体外及体内各项实验评价其生物相容性，为后续实验中MSNs载药系统的建立及应用提供理论基础。方法：采用经典St ber法合成二氧化硅胶体球，并以此材料为前体制备MSNs。采用扫描电镜、透射电镜观察MSNs的形态结构，EDS分析MSNs元素组成，XRD分析MSNs衍射图谱，获取材料的结构信息。判断MSNs表面孔隙特点，并计算出其比表面积及外壳表面的孔径尺寸。细胞形态观察、MTT法及溶血实验检测MSNs的体外毒性，并将MSNs通过尾静脉注入小鼠体内，通过对小鼠30天内体重和行为的观察，组织学及血液学等检测手段评价MSNs的体内毒性。结果：本实验所合成的MSNs为大小均一，直径约400nm的空心球体结构，比表面积为498m2/g。其表面具有介孔结构，平均直径为4.32nm。体外实验表明，浓度为200μg/ml的MSNs对细胞形态及活性均无显著影响，且溶血率小于1%。体内实验中，MSNs在小鼠脾脏及肝脏累积最多。100mg MSNs/kg的剂量条件下，小鼠的体重、行为、血液学及主要脏器的组织学检测均显示MSNs没有显著毒性。结论：本实验所制备的空心MSNs具有较高的生物相容性及较低的毒性，可以作为一种安全、高效的纳米药物载体。该纳米材料在纳米载药系统的应用中有着巨大的潜力。 3.载贝尼地平硅酸镁纳米球对成骨细胞功能的影响目的：制备载贝尼地平药物的硅酸镁纳米球（BD-MSNs），探讨该纳米载药系统对于成骨细胞增殖、分化及矿化的作用，为其日后促进成骨作用的相关临床应用提供理论基础。方法：制备BD-MSNs纳米载药系统并测定其载药量。以含有BD浓度为10-7mol/L的BD-MSNs为实验浓度，，观测该浓度纳米载药系统对于MC3T3-E1细胞形态的影响，并通过MTT法、ALP活性水平及茜素红染色检测BD-MSNs对MC3T3-E1细胞增殖、分化及矿化水平的影响，并以相同浓度BD做为对照，比较该纳米载药系统促进成骨作用的优越性。结果：所制备的BD-MSNs载药量为450mg/g，即当BD浓度为10-7mol/L时，所含MSNs浓度为12.04μg/ml，且该浓度下BD-MSNs对于MC3T3-E1细胞形态无显著影响。与相同浓度单纯BD药物相比，BD-MSNs能够显著促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化及矿化。结论：本实验所制备的BD-MSNs具有良好的生物安全性，体外实验证实BD-MSNs纳米载药系统较单纯BD药物促进成骨的作用更为显著。 4.载阿霉素硅酸镁纳米球在抗肿瘤治疗中的应用目的：以硅酸镁纳米球（MSNs）作为药物载体，制备载阿霉素（DOX）的纳米载药系统（DOX-MSNs），测定其载药性能及药物释放特性，通过体外及体内实验检测其抑制肿瘤的作用效果。方法：分别将不同浓度的DOX药物溶解于pH为5~8的溶液中，每份样品中加入MSNs10mg，搅拌以制备不同载药量的DOX-MSNs，并检测载药量及药物释放特性。选择HepG2细胞作为肿瘤细胞模型，细胞内吞实验检测MSNs在HepG2细胞中的聚集情况，通过MTT法检测该纳米载药系统于体外对肿瘤细胞的抑制效果。建立荷瘤小鼠的动物模型，通过观测小鼠肿瘤的体积变化及TUNEL试验检测肿瘤细胞凋亡情况，评价DOX-MSNs于动物体内抗肿瘤的作用效果。结果：本实验中制备的DOX-MSNs在DOX浓度为500μg/ml，pH为8的条件下载药量最高，达到2140mg/g。24h内DOX-MSNs在pH为5.0条件下药物释放量显著高于pH为7.4条件下的释放量。细胞内吞实验显示MSNs能够进入肿瘤细胞内部并大量聚集于溶酶体中。MTT结果显示DOX-MSNs抑制肿瘤细胞增殖的效果较相同浓度单纯DOX药物的作用效果更为显著。体内实验对于肿瘤体积的观测及TUNEL试验检测肿瘤细胞凋亡的结果也显示DOX-MSNs能够显著抑制肿瘤的生长。结论：本实验制备的DOX-MSNs载药量高，且药物释放具有pH敏感性。MSNs纳米药物载体能够大量聚集于胞内溶酶体中，有利于提高所载化疗药物的作用效果。DOX-MSNs较单纯DOX药物抑制肿瘤生长的作用效果更为显著。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R783

【参考文献】