类脂A结合肽的筛选和修饰及其在内毒素中和过程中的作用

发布时间：2020-03-23 17:59

【摘要】： 牙髓炎、根尖周炎和牙周炎等疾病均是G~-厌氧细菌为主的混合感染，而G~-细菌的主要毒力因子就是内毒素。因此，内毒素解毒剂有益于口腔疾病的治疗和预防。内毒素(endotoxins，ET)是G~-细菌外膜组份，其化学本质是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，由O-特异性多糖链、核心寡糖和类脂A构成，类脂A是内毒素结构中最保守部分，也是内毒素的“毒力中心(endotoxic principle)”，所以类脂A是中和内毒素活性的理想靶标。用小分子中和内毒素活性是一个活跃的研究方向，高亲和力是小分子中和内毒素活性的前提和关键，小分子分为肽类和非肽类，肽类是研究的主要方向。噬菌体展示肽库提供了一种根据亲和力高低从大量随机肽序列中筛选目标短肽的方法。本研究以类脂A为靶标筛选噬菌体展示肽库，化学合成其中一条肽序列并评价其在内毒素中和过程中的作用，主要进行了以下实验：一应用噬菌体展示肽库技术筛选内毒素类脂A部分的结合肽用氯仿：甲醇(4：1)混合液溶解类脂A，用甲醇稀释到所需浓度包被酶联板孔10μg/孔；以类脂A为靶标筛选噬菌体展示十二肽库，共筛选三轮；挑选第三轮筛选到的噬菌体，进行ELISA和竞争ELISA鉴定，然后测序，ELISA结果显示，大部分第三轮洗脱的噬菌体特异结合于包被的类脂A，表明这种包被类脂A的方法是可行的。用20μg/孔的多粘菌素B可以完全竞争抑制噬菌体克隆和类脂A的结合，进一步表明这种方法包被的类脂A能够被多粘菌素B识别，并且筛选到的噬菌体克隆和多粘菌素B在类脂A上的结合位点相近或相中文摘要同。测序结果显示，其中一条肽AI（HLFNVS－）和多粘菌素B （ttio－K’TK’七 1KK且丛里对）的部分氨基酸组合相似（下划线标出的残基人使用NCBI上的BLASTP寻找最匹配的短序列，可以发现有些蛋白质含有与 AI氨基酸组合相似的氨基酸序列，这提示这些蛋白质可能与类脂A结合。用 AI全部和部分氨基酸序列检索美国专利数据库，没有发现申请保护这段序列的专利，用这段序列中的“ LKK（亮氨酸一赖氨酸一赖氨酸）”检索到三个有关内毒素结合和／或中和肽的专利，，这些专利申请保护的多个序列含有LKK组合。用蛋白质一级结构预测软件分析了AI肽的一些重要参数。二类脂A结合肽的化学合成及其在内毒素中和过程中的作用固相化学合成 AI序列，CIS柱纯化合成肽，在 THP－l细胞模型和小鼠内毒素致死模型上观察合成肽的作用。合成肽的终产物纯度为98．56％，质谱测定的合成肽分子量为1495．7与理论分子量 1495了7一致。 THP一细胞在本培养条件下基本上不分泌TNFa，这主要得益于无内毒素操作。随着培养液中内毒素（E colt Oill：B4，Sigma浓度的升高，THPI细胞分泌 TNFa的量呈“了”状升高；内毒素浓度在 sng／inl和 200ng／ml的范围内时， TNF七分泌量呈线性上升，所以选用 50ng／ffil LPS作为刺激浓度。20％FBS，多粘菌素B可降低内毒素刺激THPl细胞分泌IN’－－－a，4pg／ml多粘菌素B自够使 TNF0分泌量降低 43．9％。MTh法检测 THP－l细胞活力，高浓度多粘菌素B使细胞活力下降，但多粘菌素B宅4p咖1时不影响活力。无血清时，合成肽调理增强内毒素刺激THP－1细胞的能力，类似于LBP 20％FBS时，合成肽的这种调理素样作用不明显；20％FBS时，合成肽增强多粘菌素B中和内毒素的能力。表明这段肽较LBP更倾向于把内毒素转运向中和途径。预实验的结果显示，C57BL／6J小鼠对内毒素的敏感程度大于Balb／c小鼠， Balb儿 ’J’鼠对内毒素的敏感程度大于昆明鼠。腹膜内注射 D一氨基半乳糖 10mg 致敏C57BL历J小鼠（体重。14g），再腹膜内注射内毒素100ng可以得到100％死亡率团用卜合成肽单独不能降低内毒素致死模型小鼠的死亡率p侣）；10pg多粘菌素 B可以中和 100fig内毒素作用，完全保护小鼠仰卜腹膜内注射 D一氨基 2 中文摘要半乳糖 10mg致敏后，lpg多粘菌素 B不能降低 200ng内毒素导致的小鼠死亡率侣／8）；l吃多粘菌素 B和 50阳合成肽能降低 200ng内毒素导致的小鼠死亡率（4／8）。三修饰后的奖脂A结合肽在内年景中和过征中作用的初步研究 AI肽的氨基酸序列（HLNSH一S）和另外一条报道的内毒素中和肽GZ的氨基酸序列h＊－G’对山红土生（K”）生）存在一些相同的氨基酸组合（带下划线的残基），阴影着重标出了疏水氨基酸。根据GZ肽的结构，新设计一条肽序歹 AI：＊＊。－H’l‘FgN‘VYHSW4L‘K‘”’沁，K’连接于 K‘的。位氨基，K’连接于 K‘的 a位氨基。固相化学合成 AI’肽，终产物的纯度为 94．9％，质谱测定的合成肽分子量为1535石，与理论分子量1535．86相符。 10％FBS时，30ng／ml TPA活化 THP
【图文】：

亲疏水性

应用噬菌体展示肚库技术筛选内毒素类脂A部分的结合肤2.5多月太序列的初步分析经软件计算，Al肤的pHi值约为l0.6(图1一2):不稳定系数(II)为9.97，这表明这段肤是稳定的;由于该序列的N端为组氨酸，所以估计的半衰期为3.5小时(哺乳动物网状细胞，体外);把多肤序列重复一次成24个氨基酸残基进行Eisenberg疏水性分析(图1一3)，结果显示Al肤序列的N端为疏水区，C端为亲水区。Al月太的螺旋轮(hehcalwheel)显示该分子有一定的双歧性、(amphipathieity)[“·‘5〕。Notohorgep曰i~O，0.615图1一2Al肤的理论滴定曲线

色谱图,色谱图,内翻

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【学位授予单位】：中国人民解放军第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R780.2

【参考文献】