犬牙囊干细胞膜片的构建及生物学特性的研究

发布时间：2020-03-25 08:08

【摘要】：牙周病可导致牙周支持组织的破坏，例如牙槽骨的急性或慢性吸收，进而牙齿脱落，最终形成牙周缺损。因此，牙槽骨的再生，成为了临床医生修复牙周缺损的重要目标。过去二十年中临床应用各种方法包括外科手术、咬合屏障膜、骨移植、骨传导生物材料等修复牙周缺损，均未取得理想的效果。随着细胞膜片技术的快速发展，细胞膜片已成为组织工程研究的热点之一。该技术也为牙周缺损的修复带来了新的活力和生机。牙囊组织含有形成牙周膜、牙骨质、牙槽骨的前体细胞，这些前体细胞在特定条件的诱导下可分化为成牙骨质细胞、成骨细胞、成脂细胞、软骨细胞等，具有很强的干细胞特性，统称为牙囊干细胞（DFSCs）。而随着智齿阻生发病率的升高，拔除的带有牙囊组织的智齿为我们提供了丰富的DFSCs来源。目的：从比格犬尖牙牙胚中分离出牙囊干细胞（Dental Follicle Stem Cells,DFSCs），对其进行形态观察，干细胞鉴定、增值和分化能力检测，并以犬的牙囊细胞作为种子细胞构建细胞膜片，并对该膜片的生物学特性进行研究。方法：从4至6月龄犬离体尖牙分离牙胚，胶原酶消化，获得牙囊细胞，体外培养取第3代细胞进行细胞克隆形成、细胞流式鉴定等。然后用含抗坏血酸的培养基诱导2周构建细胞膜片。构建成功后，通过倒置显微镜、HE染色、扫描电镜(SEM)对牙囊细胞膜片进行形态学检测。于细胞膜片构建10天时，对细胞膜片分别进行成骨、成脂诱导，连续诱导2周，行茜素红染色及油红O染色，镜下观察成骨、成脂情况。结果：DFSCs在体外被成功分离、纯化、培养，细胞克隆形成率约为5.1%。细胞流式鉴定为CD29（+）、CD44（+）、CD34（-）。MTT显示DFSCs增殖能力较强。细胞周期检测结果为：G1=87.1%，G2=5.54%。牙囊细胞成膜诱导2周后，获得白色膜状细胞膜片。HE染色显示该膜片由2～4层细胞组成，扫描电镜(SEM)示细胞排列紧密，细胞基质分泌多。细胞膜片成脂诱导14天，经油红O染色后，镜下可见大量脂滴形成；细胞膜片成骨诱导14天，，经茜素红染色后镜下可见大量清晰的钙结节形成。结论：本研究我们已成功探索出比格犬牙囊细胞膜片构建方法，并证明其具有很强的成骨能力。为进一步应用犬DFSCs细胞膜片修复牙槽骨缺损的研究提供前期的准备和条件。
【图文】：

生长曲线,体外分离,生长曲线,纵坐标

图 1 DFSCs体外分离培养:(A)原代DFSCs24h完全贴壁并伸展(B)第3代得到纯化的DFSCs。s preparation:(A)Primary passage DFSCs adhered and spreave been purified at the 3rd passage.MTT assay00.050.10.150.20.251 2 3 4 5 6 7 8Time(d)MTT(OD)DF验结果：生长曲线呈S形。横坐标为天数(d)，纵坐标为光密

细胞周期,检测结果,细胞集落,克隆形成

图 3 DFSCs细胞周期检测结果：G1=87.1%, G2=5.54%, S=7.32%。Fig 3 Representative DFSCs cell-cycle distribution：G1=87.1%, G2=5.54%, S=7.32%.图 4 克隆形成：(A) 培养14天后细胞个数超过50个的细胞集落.(B) 每个培养皿上形成的细胞集落数。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R781.4

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