一氧化碳释放分子-3对白介素-1β诱导的大鼠髁突软骨细胞凋亡的影响研究

发布时间：2020-03-27 12:36

【摘要】：目的以大鼠颞下颂髁突软骨细胞为体外模型,用白细胞介素-1β模拟颞下颂关节骨关节炎中的细胞环境,探究一氧化碳释放分子-3对白细胞介素-1β诱导的软骨细胞中Ⅱ型胶原及凋亡相关因子Bax/Bcl-2的影响和可能的机制。方法取3-4周龄,体重约为100克左右的Wistar大鼠,无菌条件下分离髁突软骨(位于髁突头部,呈乳白色),用0.25%胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶交替消化后进行大鼠髁突软骨细胞的体外培养,显微镜下观察。取第二代细胞制作爬片,配置甲苯胺蓝染色液,行细胞鉴定;取第三代细胞加药处理,提取总RNA和总蛋白,具体条件为用白细胞介素-1β处理细胞24小时,浓度分别为0,1,5和1Ong/ml,收集细胞用于进一步分析。从基因和蛋白水平分别检测各组细胞中Ⅱ型胶原及凋亡相关因子Bax/Bcl-2的表达变化,以此确定诱导髁突软骨细胞的最佳白细胞介素-1β工作浓度;细胞分别用浓度为100,200,400μM的一氧化碳释放分子-3(CORM-3)预处理24小时后,弃原培养基,换用1Ong/ml白细胞介素-1β处理,24小时后使用CCK-8测定法检测细胞的活力,提取总RNA,进行实时定量聚合酶链反应,检测相关基因Ⅱ型胶原和Bax/Bcl-2的表达,以此确定后面实验最佳的一氧化碳释放分子-3工作浓度;接着将活性较好的软骨细胞用200μMCORM-3和degassed CORM-3(提前24小时配置并释放完一氧化碳气体)预处理,24小时后换用10ng/ml白细胞介素-1β刺激。收集细胞并取适量悬液,应用凋亡试剂盒后上机检测凋亡情况,提取总蛋白,用蛋白印记法检测相关蛋白Ⅱ型胶原和Bax/Bcl-2的表达;为了探究可能的机制,取上述总蛋白用蛋白印迹法检测各组中血红素加氧酶-1的表达情况。结果①镜下观察分离后的软骨细胞贴壁后呈多角形,培养7-8天后达到汇合状态,似“铺路石”状。传代后细胞较原代分布均匀,增殖速率加快,细胞状态良好。第四代以后的细胞呈不规则生长,部分细胞似有触角伸出,形状由多角形转变为长梭形,生长速率明显变慢;镜下观察染色后的细胞,多数胞核为圆形,呈深蓝色,胞质呈淡蓝色,细胞间有大量深蓝色的颗粒状物质,为分泌到细胞外基质的蛋白聚糖。②髁突软骨细胞中Bax mRNA和蛋白的表达随着IL-1 β浓度的升高而增加,Bcl-2以及细胞外基质Ⅱ型胶原mRNA和蛋白的表达随着IL-1β浓度的升高而降低,且都呈剂量依赖性,根据实验结果,选择1Ong/ml作为后续实验的IL-1β工作浓度。③用浓度为100,200,400μM的CORM-3预处理细胞后,与IL-1β刺激组比较,髁突软骨细胞存活率明显提高,细胞中Bax mRNA的表达显著降低,Bcl-2和Ⅱ型胶原mRNA的表达明显增加,差异有统计学意义,且20μM CORM-3预处理组作用效果最显著,200μM可作为后续实验的最佳工作浓度。④流式细胞术结果显示,IL-1β+200μM CORM-3预处理组细胞凋亡率明显低于IL-1β刺激组,CORM-3对细胞凋亡的影响是由其释放的CO介导的,degassed CORM-3预处理组不能抑制细胞凋亡,其凋亡率与IL-1β刺激组比较无明显差异;degassed CORM-3预处理后消除了正常CORM-3对IL-1 β刺激的细胞中Bax,Bcl-2和Ⅱ型胶原表达的调节作用;⑤degassed CORM-3预处理组细胞中HO-1蛋白表达与IL-1β刺激组相比无显著差异,而200μM CORM-3预处理组细胞中HO-1蛋白表达较IL-1β刺激组和degassed CORM-3预处理组显著增加。结论一氧化碳释放分子-3可抑制白细胞介素-1β诱导的大鼠髁突软骨细胞凋亡,促进细胞中Bcl-2及Ⅱ型胶原的表达同时减少Bax的产生;可能的机制为一氧化碳释放分子-3激活血红素加氧酶-1蛋白来发挥其抗凋亡的作用。
【图文】：

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图１－１大鼠髁突软骨细胞的体外培养逡逑ｖ逦，，逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R782.6

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本文编号：2602960