超声微泡介导pEGFP-N1转染HPDLFs的实验研究

发布时间：2020-03-31 22:43

【摘要】： 牙周炎是由牙菌斑中微生物所引起的牙周支持组织的慢性感染性疾病,可导致牙周组织炎症、牙周袋形成、进行性附着散失和牙槽骨吸收,甚至牙松动和牙脱落。由于牙周组织的再生能力有限,传统的牙周治疗可去除感染及病变组织,修整因牙周病变所造成的软硬组织缺损,有一定程度的牙槽骨修复作用,但这种牙周组织的修复非常有限,不能完全恢复牙周组织正常生理结构。在实现牙周组织再生中,牙周膜细胞充当着关键作用,是牙周组织再生和形成新附着的基础成分。牙周膜细胞包括牙周膜成纤维细胞(periodontal ligament fibroblasts,PDLFs)、成骨细胞、成牙骨质细胞等。但在牙周炎症或创伤时,牙周膜再生细胞数量及其生物学功能的降低则阻碍了牙周组织的完全再生。基因治疗技术的出现为实现牙周再生提供了新的思路。通过基因转移将外源目的基因导入靶细胞中,既可使治疗性蛋白在特定区域持续高表达,又能在局部产生微环境,诱导细胞定向分化,从而有效促进牙周组织再生。 本研究探讨超声微泡介导绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因转染人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,HPDLFs)的效率及对细胞生长活性的影响,优化转染的相关条件,为进一步用基因治疗牙周炎提供新思路与实验基础。 目的: 探讨超声微泡造影剂在一定能量的超声波辐照下,介导pEGFP-N1质粒转染HPDLFs的有效性及安全性,为实现牙周炎的基因治疗奠定基础。 方法: 体外原代培养HPDLFs,以EGFP基因为报告基因,脂质微泡造影剂为载体,用超声辐照微泡介导质粒pEGFP-N1转染HPDLFs。根据影响超声微泡转染的三个不同因素和相同因素下不同水平分组,即不同的辐照时间(10 s、30 s、45 s、60 s)、超声强度(0.5 W/cm2、1W/cm2)与微泡浓度(10%、15%、20%)共分成24组,计算出各组的转染率,筛选出具有较高转染率的参数组合。再以转染率最高的参数组合为实验组,分别与质粒组、微泡+质粒组、超声+质粒组和脂质体+质粒组比较各组间的转染率。同时MTT法检测在此转染条件下HPDLFs的活性。 结果: 通过研究不同声强、辐照时间、微泡浓度下的转染率,筛选出当声强为0.5 W/cm2、间断波辐照时间60 s、微泡浓度15%时对HPDLFs具有最高的转染率和较少的细胞损伤。同时,超声微泡介导质粒转染HPDLFs在转染率方面与传统的脂质体介导质粒的转染率相似,但超声+微泡+质粒组中HPDLFs的活力明显高于脂质体+质粒组。 结论: 本实验以超声微泡造影剂为基因载体对体外培养的HPDLFs进行转染,并与传统的脂质体转染方法进行比较,探讨合适的超声微泡转染条件及其对HPDLFs生长活性的影响。证实超声微泡能有效地介导外源基因在HPDLFs中安全、有效的转染与表达,有望成为一种安全、有效的基因转染方法,为实现牙周再生的基因治疗奠定了基础。
【图文】：

（图 1-1-1）从组织块边缘游出的细胞（100×）G. 1-1-1)Cells emigrating form edge ofsue（图 1-1-2）第九天原代培养的牙周纤维细胞（100×）(FIG. 1-1-2) primary culture HPDLFthe ninth day（图 1-1-4）HPDLFs 波形蛋白免疫细胞化学染色阳性（100×）(Fig.1-1-4) primary culture HPDLFscytochemical staining vimentin is masc.（图 1-1-5）HPDLFs 角蛋白免疫细胞学染色阴性（100×）(Fig.1-1-5) Primary culture HPDLcytochemical staining keratin is negativ

第 3 代 HPDLFs 的免疫细胞化学染色结果：抗波丝蛋白在细胞浆中呈阳性表达（细胞将呈棕黄色），而角蛋白染色阴性（图 1-1-4，，1-1-5）。（图 1-1-1）从组织块边缘游出的细胞（100×）(FIG. 1-1-1)Cells emigrating form edge oftissue（图 1-1-2）第九天原代培养的牙周膜成纤维细胞（100×）(FIG. 1-1-2) primary culture HPDLFs othe ninth day
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R781.4

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本文编号：2609670