Smurf1介导的对Runx2表达调控在牙髓干细胞向成牙本质细胞分化中的作用

发布时间：2020-04-04 22:30

【摘要】：Runx2是一种胚胎发育期在牙源性和骨源性间充质细胞中均有表达的转录因子。研究显示，发育期间其在成骨细胞和成牙本质细胞分化过程中表达趋势不尽相同，提示分化过程中Runx2特定的表达形式可能是决定细胞向成骨或成牙本质细胞分化的关键因子。泛素化修饰可通过控制Runx2蛋白的稳定性，调控Runx2的蛋白表达水平，Smurf1是蛋白泛素化降解调控通路中一种重要的E3泛素连接酶，其介导的泛素-蛋白酶体途径是调控Runx2表达的重要机制。那么Smurf1介导的Runx2泛素化蛋白降解途径是否在牙髓干细胞向成牙本质细胞分化过程中发挥着重要的作用呢？ 实验目的：本课题旨在比较Runx2在成牙本质细胞和成骨细胞分化过程中的表达水平和变化趋势，并利用shRNA慢病毒表达载体探讨牙髓干细胞内Smurf1对Runx2的表达调控作用，以及其在不同分化阶段对成牙本质细胞分化表型的影响，以揭示Smurf1介导的Runx2泛素化蛋白降解在牙髓干细胞向成牙本质细胞定向分化中发挥的调控作用。 实验方法: 1.人牙髓干细胞（HDPSCs）的分离、培养及鉴定 通过酶消化法和有限稀释法分离纯化出HDPSCs克隆，并进行扩大培养。利用流式细胞技术鉴定其间充质干细胞表面标记物，同时诱导细胞多向分化并进行鉴定。 2.检测并比较Runx2在干细胞向成牙本质和成骨细胞分化过程中的表达变化 矿化液诱导培养人牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞3周，鉴定成牙本质细胞和成骨细胞分化表型，Western blot和实时定量PCR动态检测矿化液诱导培养0d,3d,5d,7d,14d,21d成牙分化和成骨分化过程中Runx2的表达变化。 3.探讨牙髓干细胞内Runx2表达受Smurf1介导的蛋白降解途径调控 通过Smurf1shRNA慢病毒转染技术使牙髓干细胞内Smurf1基因沉默，然后用矿化诱导液诱导细胞分化，Western blot和实时定量PCR检测Runx2的表达，同时采用蛋白酶体抑制剂MG132和蛋白合成抑制剂cycloheximide分别处理未分化的HDPSCs和Smurf1基因沉默HDPSCs，Western blot检测Runx2的表达。 4.研究Smurf1对成牙本质细胞分化表型的影响 对Smurf1shRNA转染的牙髓干细胞进行矿化诱导培养7d和14d，茜素红染色检测矿化结节的形成，Western blot检测Runx2的表达，实时定量PCR检测成牙本质细胞相关表型的变化。 结果： 1.细胞鉴定结果证实，所培养细胞为牙髓干细胞（DPSCs），具有干细胞相关特性，并且在矿化液诱导下可分化为成牙本质细胞，经成脂诱导可分化为脂肪细胞。 2. Runx2在人骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化过程中表达逐渐增高，细胞分化越成熟，表达越强。但在牙髓干细胞向成牙本质细胞定向分化过程中，Runx2表达总体呈先高后低的趋势，细胞分化早期较未分化时表达增高，到分化晚期和分化成熟时表达则明显下降。 3.在Smurf1shRNA转染的未分化HDPSCs内以及细胞经矿化诱导培养7天后，Runx2表达均明显增加，且这种表达变化仅体现在蛋白水平，Runx2mRNA水平的表达并无明显变化。蛋白酶体抑制剂MG132可使HDPSCs内Runx2蛋白水平明显增加，而Smurf1shRNA转染细胞经可阻断新蛋白的合成的蛋白合成抑制剂cycloheximide处理后，其内Runx2蛋白半衰期延长，降解速度明显减慢。 4. Smurf1基因沉默可明显促进矿化结节的形成；其对早期矿化基因表达并无明显影响；而在矿化晚期，而细胞内成牙本质细胞分化相关基因DSPP、DMP-1的表达降低，成骨细胞分化相关基因OCN、BSP的表达则增强。细胞成牙分化减弱，成骨分化增强。同时，Smurf1基因沉默明显上调了成牙本质细胞分化晚期Runx2的蛋白表达。 结论：Smurf1在牙髓干细胞向成牙本质细胞分化的过程中通过UPS介导了对Runx2的泛素化降解。同时Smurf1还在成牙本质细胞分化晚期发挥重要作用，而这种作用可能是通过其介导的对Runx2的蛋白酶体降解来实现的，这可能作为一种调控细胞定向分化的关键机制参与调控成牙本质细胞的分化。 为了进一步深入研究牙髓干细胞定向分化机制，慢病毒过表达载体将被用于进一步验证实验结果，，Runx2shRNA用于深入探讨Smurf1介导的Runx2泛素化蛋白降解在成牙本质细胞定向分化中的调控作用，后续研究将着重于裸鼠体内移植实验，以研究该调控作用在组织工程领域的应用。
【图文】：

A. 消化后贴壁的单细胞 B. 7 天后细胞达到 90%融合图 1 HDPSCs 的原代培养图（40×）克隆培养后细胞的形态和生长状况标记单个细胞生长的孔（图 2A），在 3d 左右可观察细胞呈成纤维细胞样克FU-F）（图 2B）；大约 7-10 天后，细胞生长迅速并形成大克隆（图 2C）。克细胞排列十分紧密，从中心向四周呈放散性生长，中心部分细胞大多界限细胞呈短梭形或多角形样。A B C

第四军医大学硕士学位论文3.3 HDPSCs 的流式细胞鉴定HDPSCs 高表达间充质干细胞标志物 Stro-1（14.9%）、CD29（>95%）、CD90（>95%）、CD105（>85%）以及血管内皮细胞标记分子 CD146（>95%）；不表达造血干细胞标志物 CD34 和 CD45（<5%），与相关文献结果一致[7]（图 3）。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R781.3

【参考文献】

相关期刊论文 前9条

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本文编号：2614149