牙龈卟啉单胞菌感染诱导巨噬细胞表达淀粉样蛋白的研究

发布时间：2020-04-10 14:12

【摘要】：实验目的:慢性牙周炎是由菌斑微生物始发、宿主免疫炎症反应及其他多种因素共同导致的牙齿支持组织破坏性疾病,其发生与发展与全身系统性疾病密切相关,其主要致病菌是以牙拃卟琳单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)为主的革兰氏阴性厌氧菌。阿尔茨海默病是较常见的进行性神经认知障碍,脑内淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)的异常沉积是阿尔茨海默病重要的病理标志。众多研究表明,慢性牙周炎和阿尔茨海默病具有相关性。我们已经证明,牙龈卟啉单胞菌脂多糖可以诱导脑内Aβ沉积。该实验的目的是探究在P.gingivalis感染的外周巨噬细胞中,是否会引起外周Aβ的异常表达。实验方法:(体内实验)实验动物模型建立:12月龄野生雌性小鼠随机分为实验组(n=10)和对照组(n=10)。实验组腹腔注射三周P gingivalis,对照组腹腔注射三周等量磷酸盐缓冲液。1.Real-time PCR检测P.gingivalis感染后,小鼠肝脏中Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)、白细胞介素1(interleukin-1,IL-1)β、Aβ生成相关蛋白——淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)、组织蛋白酶(Cathepsin,Cat)B以及Aβ降解相关蛋白(中性内肽酶、胰岛素降解酶、血管紧张素转化酶)的mRNA表达。2.免疫荧光染色观察Pgingivalis感染后,小鼠肝脏巨噬细胞中TLR2、IL-1β、APP、CatB、Aβ的表达。(体外实验)P.gingivalis感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7。3.Real-time PCR检测P.gingivalis感染巨噬细胞系RAW264.7后,不同时间点TLR2、IL-lβ的mRNA表达;Western blotting检测在Cat B抑制剂和核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)抑制剂预处理下,P.gingivalis感染的巨噬细胞系RAW264.7中,IL-1β前体和IL-1β的蛋白表达。4.Real-time PCR检测P.gingivali 感染巨噬细胞系RAW264.7后,不同时间点APP、Cat B的mRNA表达;免疫荧光染色观察在Cat B抑制剂和NF-κB抑制剂预处理下,P.gingivalis感染巨噬细胞系RAW264.7中,Aβ的表达。5.免疫荧光染色观察慢性牙周炎患者牙龈组织巨噬细胞中APP、Cat B和Aβ的表达。6.实验结果采用Graphpad Prism7软件,进行单因素或双因素方差分析。实验结果:1.P.gingivalis感染诱导了小鼠肝脏巨噬细胞中TLR2、IL-lβ、APP、CatB、Aβ表达增加,但未影响Aβ降解酶(中性内肽酶、胰岛素降解酶、血管紧张素转化酶)表达变化。巨噬细胞呈现促炎表型。2.P.gingivalis感染巨噬细胞系RAW264.7诱导TLR2、IL-lβ、APP、Cat B、Aβ的表达增加,同时Cat B和NF-κB参与调控IL-lβ和Aβ的表达。3.慢性牙周炎患者牙龈组织巨噬细胞中APP、Cat B和Aβ高度表达。结论:慢性P.gingivalis感染通过激活NF-κB信号通路和Cat B诱导巨噬细胞表达Aβ,表明在慢性牙周炎感染条件下,巨噬细胞可在外周Aβ生成过程中起重要作用。Cat B抑制剂可成为通过减少外周Aβ及炎症反应来预防阿尔茨海默病的新型治疗靶点。
【图文】：

逦感染对炎症因子及与ＡＰ生成相关蛋白表逡逑达的影响。我们发现，与对照组相比，感染雌性中年小鼠后，ＴＬＲ２逡逑和炎症因子ＩＬ－ｌｐ在小鼠肝脏中的平均ｍＲＮＡ表达显著增加（图３．１Ａ）。同时，逡逑与Ａｐ生成相关蛋白——ＡＰＰ７７0和Ｃａｔ邋Ｂ在小鼠肝脏中的平均ｍＲＮＡ表达明显增逡逑加，然而ＢＡＣＥ１的表达无显著性差异（图３．１Ｂ）。逡逑接下来检测慢性系统性Ｐ．逦感染对ＡＰ降解酶表达的影响。ＡＰ降解逡逑酶中性内肽酶ＮＥＰ、胰岛素降解酶ＩＤＥ、血管紧张素转化酶ＡＣＥ在小鼠肝脏中逡逑的平均ｍＲＮＡ表达无显著性差异（图３．１Ｃ）。逡逑因此，慢性系统性Ｐ．邋ｇ／ｔｔｇ／ｖａｔｏ感染诱导了小鼠肝脏ＴＬＲ２、炎症因子ＩＬ－ｉｐ逡逑表达增加，Ａｐ生成相关蛋白（ＡＰＰ、Ｃａｔ邋Ｂ）表达增加，但未影响Ａｐ降解相关逡逑蛋白（ＮＥＰ、ＩＤＥ、ＡＣＥ）表达变化。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑６，逦５＊逡逑ｇ逦＊＊＊□邋Ｓａｌｉｎｅ邋ｇ逦＊＊＊逦□邋Ｓａｌｉｎｅ逡逑｜逦Ｈ邋Ｐｇ邋＾邋４－邋－ｒ逦＊＊＊逦■邋Ｐｇ逡逑ｉｊｎｉ邋ｎ８逦ＩＬＬ逡逑ＴＬＲ２逦ＩＬ－ｉｐ逦ＡＰＰ逦ＣａｔＢ逦ＢＡＣＥ１逡逑ｃ逡逑１．５＾逡逑＝逦□邋Ｓａｌｉｎｅ逡逑｜逦■邋Ｐ－９逡逑Ｉ邋ｌ．0－邋￣￣逦￣邋Ｔ邋￣ＩＴ逡逑ｒｌｌＭｌ逡逑°＇邋ＮＥＰ

３．２邋Ｐ．邋ｇ／叹／ｗｉｔｏ感染促进ＴＬＲ２和ＩＬ－ｉｐ在肝脏巨噬细胞中表达逡逑免疫焚光染色显示，与对照组相比，尸．感染雌性中年小鼠后，ＴＬＲ２逡逑在小鼠肝脏巨噬细胞中表达显著增加（图３．２Ａ、Ｃ），ＩＬ－ｉｐ在巨噬细胞中表达逡逑也显著增加（图３．２Ｂ、Ｃ）。逡逑由此可见，慢性系统性Ｐ．逦感染诱导ＴＬＲ２和ＩＬ－ｌｐ在巨噬细胞中逡逑表达增加，肝脏巨噬细胞呈现促炎表型。逡逑ｃ逡逑＊＊＊邋ｎ邋Ｓａｌｉｎｅ逡逑１，５－逦＊＊＊逦Ｔｍｐ．ａ逡逑ｉＬＬｑＩ逡逑Ｉ逦ＴＬＲ２逦ＩＬ－ｉｐ逡逑图３．邋２邋Ａ邋＾７Ａ７＾７Ｖａ／／ｓ感染促进ＴＬＲ２和丨Ｌ－１邋（３在肝脏巨卩筮细胞中表达逡逑Ａ：免疫荧光染色显示对照组和Ｐ．ｇｈｇ／ｖａｔｅ感染小鼠肝脏中ＴＬＲ２邋（绿色）和巨噬细胞（Ｉｂａｌ，，逡逑红色）共定位表达（ｓｃａｌｅ邋ｂａｒ邋＝邋１５ｐｍ）逡逑１４逡逑
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R781.4

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本文编号：2622324