重组腺病毒BMP-9对牙囊干细胞成骨向诱导分化的研究

发布时间：2020-04-10 17:34

【摘要】：牙周炎作为人类最普遍、最古老的疾病之一，是一种慢性感染性疾病；牙菌斑中的微生物引起牙齿支持组织形成炎症、产生深牙周袋、附着丧失与牙槽骨的垂直性或水平性吸收，最终导致牙齿松动和脱落；也是成年人牙齿缺失的主要原因[4]。牙周骨缺损修复和正常生理结构与生理功能的重建是牙周炎治疗的最终目的,目前对骨上袋缺损的再生性修复尚缺乏行之有效的治疗手段，不可能实现真正意义上的牙周生物学修复。牙源性干细胞与牙周组织工程技术为新的生物性修复再生牙周组织及其牙齿提供了可能，即用细胞工程和生物工程化的方法实现牙周组织再生，形成新附着。应用牙源性干细胞和组织工程技术，按照牙周组织生长与发育的基本原理和基本方法来模拟再现牙周组织整个发育过程才能真正地实现牙周组织再生。再生组织工程中，种子细胞的选择具有决定性意义；细胞获取方便，移植入机体后细胞生物学活性稳定，分化增殖能力强等是理想种子细胞必备条件。发育形成牙周组织的牙囊是一种疏松结缔组织，起源于外胚间充间充质，包绕着牙胚期的成釉器和牙乳头。一般认为牙周分泌牙骨质的成牙骨质细胞由靠近正在形成中牙根的牙囊最内层细胞发育而成，而牙周组织中分泌骨基质、形成部分牙槽骨的成骨细胞是邻近牙槽骨的外层牙囊细胞发育而成；成纤维细胞由中间层牙囊细胞发育，产生牙周膜纤维。作为牙周组织前体细胞的牙囊细胞具有自我更新能力和多向分化能力的干细胞特性与异质性，如果能将牙囊干细胞（dental follicle stem cells，DFCs）分离出来，这对研究牙周组织的生长发育形成起着至关重要的作用；对牙齿移植、牙再植及牙再生均具有重要的指导意义；DFCs较强的增殖分化能力也使其成为一种值得考虑的组织工程候选种子细胞。骨形成蛋白（Bone Morphogenetic Proteins，BMPs）是一类糖蛋白，在骨的发育和塑建中起着关键性作用，可通过多种途径多种方式促进细胞向成骨部位定向趋化、募集和促进成骨细胞定向分化，促进血管的生成和组织血管化形成，调节多种局部生长因子的活性，影响生长因子的形成，促进骨组织的形成。在已知对骨再生有促进作用的生长因子中，BMPs是最强的生长因子，目前已经分离出20余种，其中已报道具有成骨潜能是BMPs2、4、6、7、9；BMP9具有诱导和维持胚胎神经元的类胆碱分化功能，能够调节脂肪酸代谢和葡萄糖代谢，能够调节体内铁离子的动态平衡等多种重要生物学功能，但长期以来人们缺乏研究和了解BMP9在骨形成和骨再生中的作用。TC HE系统研究了在骨形成过程中的BMP2至BMP15共14种BMPs所起的生物学作用，结果表明这14种BMPs中，BMP9具有很强的促进软骨形成与成骨活性，作用强于BMP2和BMP7，也是BMPs家族中促进成骨分化的生长因子之一，极具研究潜力和应用前景[64,65]；但在口腔成骨方面和对DFCs的影响未见相关报道。 DFCs具有成脂肪、成骨、成神经等多向分化潜能的干细胞特征，在适当的诱导条件下，可以多向分化。然而，由于细胞因子网络性调控和信号通路的复杂性以及研究手段的限制，DFCs的具体分化调控机制尚不明确。本研究旨在着力探讨重组腺病毒BMP-9基因转染大鼠DFCs的可行性及其转染后的成骨向分化与作用机制，以获得可用于牙周骨组织再生工程的基因修饰的种子细胞，为后续牙周组织工程治疗口腔骨缺损奠定基础。研究内容和研究结果如下： 1.在解剖显微镜下，从SD大鼠下颌骨牙胚上剥离牙囊，组织块法和酶消化获取牙囊细胞原代培养、有限稀释法克隆纯化、细胞表型鉴定，成骨、成脂肪多向诱导分化，结果表明：DFCs具有成骨、成脂肪等多向分化潜能的干细胞特征，在定向成骨诱导分化过程中，没有出现成脂肪向分化。 2.腺病毒介导的BMP-9转染第三代DFCs，设立空白对照组，绿色荧光病毒组（GFP组）、BMP组，成骨诱导组、联合组。通过观察细胞形态和MTT生长曲线变化、荧光显微镜及RT-PCR检测转染后BMP-9基因mRNA的表达；碱性磷酸酶ALP活性、ALP染色及钙茜素红染色测定转染后DFCs的早晚期成骨活性。结果表明：转染的DFCs稳定表达BMP-9，说明转染后的BMP-9基因能成功被转录并表达于DFCs；与未转染对照组相比较，转染组ALP染色及茜素红钙结节染色为阳性；转染组显著高于未转染组，说明DFCs有良好的骨向分化能力，，也提示了BMP-9对DFCs有成骨诱导作用。 3.应用抑制剂p38蛋白激酶抑制剂SB203580和ERK1/2激酶抑制剂PD98059干扰BMP-9转染的DFCs，用来阻断p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）和细胞外信号调节激酶（ERK1/2)胞内信号传递，通过ALP活性及染色检测；Western blot分析；钙茜素红染色实验分析MAPKs信号通路对BMP-9诱导的DFCs成骨向分化过程中的调控和影响。结果表明：抑制MAPKp38的表达后降低了Ad-BMP-9诱导的DFCs的ALP的活性和ALP染色，且减少了钙盐沉积与骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨钙素（osteocalin,OCN）的表达；抑制ERK1/2的活性后则相反。同时，Western blot分析显示Smad和MAPK通路激活，表明BMP诱导DFCs成骨向分化涉及到两条或可能更多的信号通路激活。研究结论： 1.成功获得了大鼠DFCs克隆，合适诱导条件下能够多向诱导分化。 2.在腺病毒BMP-9转染DFCs实验中，通过RT-PCR可检测到转染后BMP-9基因mRNA的表达，碱性磷酸酶和钙茜素红染色测定转染后DFCs的早期和晚期成骨活性，说明BMP-9可以成功地转染大鼠DFCs，转染后DFCs高表达BMP-9，且具有明显的成骨作用。 3.应用MAPKp38蛋白激酶抑制剂和ERK1/2激酶抑制剂干涉BMP-9转染的DFCs，通过ALP活性及染色检测、Western blot分析、钙盐沉积实验观察BMP-9转染的DFCs成骨向分化可通过ERK1/2和p38信号通路进行调控，为后续试验奠定了基础。
【图文】：

细胞形态学,高密度,形态,细胞集落

中围绕细胞核有大小不一、散在的高密度白色颗粒存在；经传代后的第一代细胞，其内杂质细胞少见。一般7-10天左右可再次达到80%-90%融合，并进行再次传代纯化鉴定(见图1)。TEM结果提示：DFCs细胞体积较大，核仁清楚、核浆比例大，基质电子密度较高，核糖体丰富，含有特征性结构—均质性电子致密颗粒，以及大量溶酶体，表明处于此时细胞分化活跃和组织器官改造重建阶段(见图2)。传至11代细胞增殖速度逐渐减慢，细胞出现衰老征象，集落簇团现象不如以前明显。A BC DE F

均质性,溶酶体,细胞,细胞形态学

图 1 细胞形态学图片：A.原代第 1 天；B.原代第 3 天；C.原代第 4 天；D.原代第 5 天；E原代第 7 天；F.原代第 10 天；G.第 3 代 DFCs 形态(×100)；H.第 3 代 DFCs 形态(×200)；I.胞内高密度颗粒(×200)；J.细胞集落样生长Fig1 Separation and identification of DFCs. A:primary culture 1st day ;B: primary culture 3rd day;C:primary culture 4th day ; D：primary culture 5th day；E:primary culture 7th day；F：primary culture 10th day; G:the third passage cells of DFCs(×200)；H;the third passage cells of DFCs(×200)；I:High-dense granules in cells(×200)J：DFCs formed colonies and had potent proliferative activity;A B
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R781.42

【参考文献】