白介素1β对成牙骨质细胞分化的作用及机制研究

发布时间：2020-04-18 17:23

【摘要】：牙骨质是贴附在牙根表面的薄层矿化组织,是牙周组织的重要组成部分,也是正畸治疗牙齿移动的基础。在牙根发育完成后牙骨质通常不再发生生理性改建,缺乏与骨组织类似的重塑能力。在正畸治疗导致牙骨质吸收后,牙骨质的修复依靠成牙骨质细胞完成,伴随成牙骨质细胞增殖、分化及矿化,逐渐形成修复性牙骨质。因此研究如何提高成牙骨质细胞的功能对于牙骨质修复十分重要,也为防治正畸性牙根吸收和牙周组织修复提供理论基础。IL1β是感染早期最常见的细胞因子之一,可调节免疫反应介导的炎症作用,在正畸患者和牙周炎患者的牙周组织中高表达,有诱导炎症损伤、促进骨吸收和抑制成骨细胞分化的作用。但是,IL1β在牙骨质代谢中的作用,尤其是对成牙骨质细胞的作用机制研究较少,我们进行以下实验旨在探讨IL1β对成牙骨质细胞分化的作用及机制,为炎症性牙骨质丧失疾病的防治提供理论基础。1.IL1β对成牙骨质细胞的作用目的:探讨IL1β对成牙骨质细胞增殖、分化及矿化作用。方法:培养成牙骨质细胞系OCCM-30,使用IL1β重组蛋白(10 ng/mL)处理成牙骨质细胞并对其进行成牙骨质矿化诱导。MTT法检测IL1β对成牙骨质细胞增殖的影响;流式细胞术观察IL1β对成牙骨质细胞凋亡的影响;real-time PCR及Western blot法测定成牙骨质分化相关基因runx2和osterix的表达水平;微板法定量和染色法定性检测成牙骨质细胞的碱性磷酸酶活性;茜素红染色及相对定量分析矿化结节形成量。结果:IL1β对成牙骨质细胞的增殖及凋亡无影响;下调runx2和osterix的表达水平,降低碱性磷酸酶活性及矿化结节形成能力。结论:IL1β对成牙骨质细胞的分化有抑制作用。2.MiR-325-3p在IL1β抑制的成牙骨质细胞分化中的调控作用目的:在microRNA参与的转录后基因表达调控水平上,探讨IL1β抑制成牙骨质细胞分化的作用机制。方法:利用生物信息学分析技术及real-time PCR实验筛选出miR-325-3p,应用双荧光素酶及免疫荧光实验验证其靶基因。在加入IL1β刺激的同时瞬时转染miR-325-3p,检测成牙骨质细胞分化相关基因runx2和osterix的表达水平。同时,建立小鼠异位成骨模型,对移植物进行micro-CT、碱性磷酸酶活性及钙离子含量检测。结果:IL1β上调miR-325-3p的表达,且miR-325-3p直接靶向runx2。转染miR-325-3p mimic可下调成牙骨质细胞runx2和osterix的表达水平,在异位成骨实验中可显著降低新形成的牙骨质样组织的骨密度、骨体积分数、碱性磷酸酶活性及钙离子含量;而转染miR-325-3p inhibitor得到的结果与mimic完全相反。在加入IL1β刺激的炎症状态下,成牙骨质分化相关基因表达及体内成牙骨质能力显著降低;并且在转染miR-325-3p inhibitor后IL1β的作用被减弱。结论:IL1β通过上调miR-325-3p的表达,直接作用于靶基因runx2,进而抑制成牙骨质细胞分化;转染miR-325-3p inhibitor可减弱IL1β对成牙骨质细胞分化的抑制作用。3.转录组测序分析IL1β对牙骨质细胞分化的作用机制目的:在转录水平上更全面地探讨IL1β抑制成牙骨质细胞分化的作用机制。方法:对IL1β处理与非处理组的成牙骨质细胞生物样本进行转录组二代测序分析。首先,收集细胞样本,提取样本RNA,构建RNA-seq文库;其次,对文库测序并对测序数据进行质量检测、数据过滤及统计;然后,对测序数据进行差异表达分析、GO和KEGG生物信息学分析。结果:成牙骨质细胞生物样本文库构建成功;测序样本达到高质量读段控制标准;共得到112个显著差异基因,包括85个上调基因和27个下调基因;GO富集分析揭示了整个作用过程中有1735个GO功能条目被显著富集(p0.05),在免疫应答反应、对细胞外刺激反应等条目中显示富集较高;KEGG富集分析显示共有12个通路被显著富集(p0.05),其中TNF信号通路、细胞因子与受体相互作用途径、趋化因子信号通路、PI3K-Akt信号通路、Toll样受体信号通路、JakSTAT信号通路为最主要的富集通路。结论:IL1β可刺激成牙骨质细胞产生免疫应答等多种生物学反应,可能通过TNF、PI3K-Akt等信号通路途径发挥作用,为探讨IL1β抑制成牙骨质细胞分化的作用机制提供有价值的新线索。4.Lcn2对成牙骨质细胞分化的作用目的:Lcn2作为测序得到的差异最显著且表达丰度较高的“关键”基因,其在成牙骨质代谢调控中的作用亟待研究,本部分实验旨在探讨lcn2在调节成牙骨质细胞分化中的作用。方法:构建lcn2过表达质粒载体和沉默lcn2的siRNA,使用瞬时转染法建立成牙骨质细胞过表达和敲减体系;流式细胞技术检测转染效率;real-time PCR和Western blot法检测lcn2过表达和敲减的效果,以及对分化相关基因runx2、osterix等基因和蛋白表达情况的影响。结果:成功构建lcn2过表达质粒及沉默siRNA,瞬时转染效率较高。在mRNA水平上过表达lcn2显著高于对照组约25倍,敲减后约为对照组的一半;在蛋白水平上过表达lcn2表达增加约一倍,敲减后约为对照组的一半。Lcn2对成牙骨质细胞分化相关基因runx2、osterix、alp和ocn mRNA表达起负调控作用,对opn mRNA表达起正调控作用,对runx2和osterix的蛋白表达具有负调控作用。结论:Lcn2对成牙骨质细胞的分化有抑制作用。综上所述,IL1β对成牙骨质细胞分化有抑制作用,其机制可能是在microRNA参与的转录后基因表达调控层面,通过激活miR-325-3p进而抑制下游转录因子runx2的表达,完成抑制成牙骨质细胞分化的过程;也可能是在转录水平的调控,测序筛选出的关键蛋白lcn2的表达被激活,进而抑制成牙骨质细胞的分化;转录组测序结果为以后的研究提供线索,有待于进一步挖掘。
【图文】：

示意图,牙根吸收,牙骨质,示意图

图 1.1 巨噬细胞对牙根吸收过程影响示意图（引自 A. Iglesias-Linares 等[15]）牙周膜与类牙骨质层作为牙周的保护组织，参与了抵抗牙根吸收的过程，主要表现在以下两个方面：（1）类牙骨质层位于牙骨质的外层，是一层未完全矿化的薄层组织，破牙骨质细胞对牙骨质产生骨吸收作用时须先穿过类牙骨质层，相比于牙骨质层类牙骨质层富含有机成分，具有更强的物理抵抗作用，为保护牙根吸收提供第一道屏障[20]。（2）牙周膜与牙骨质间的细胞层，包含成牙骨质细胞、成骨细胞、成纤维细胞等，内环境因素改变激活其增殖、分化和矿化的能力，形成修复性牙骨质，对牙根吸收形成的牙骨质陷窝进行修复[21]。由此可知，正畸治疗常引起牙骨质破坏，导致正畸炎性牙根吸收，诱导牙骨质再生是抵抗和修复牙根吸收的主要方法。1.2 牙骨质再生是牙根外吸收修复的关键牙骨质是牙周组织的重要组成部分，位于牙周膜与牙根之间，是贴附于牙根

形态图,成牙骨质细胞,倍数,光镜

在显微镜下观察结果如图2.1 所示，细胞传代后约 4 h 即可贴壁，由漂浮的圆形细胞变成扁平贴壁的多角型细胞，细胞核位于胞浆中央，多为单核，，高倍镜下可见核仁。当细胞密度较低时，细胞体积相对较大胞浆多，可见两个以上较长突起，相邻细胞的突起可连接在一起；当细胞密度较大时，细胞间基本无空隙，细胞体积随胞浆减少而变小，细胞压缩为长梭形，可由单层生长成为复层细胞。xs
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R78

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