Amelogenin生物活性合成肽调节早期牙釉质龋生物仿生再矿化行为机制初探

发布时间：2020-04-20 23:55

【摘要】：龋病是牙体硬组织破环的一种疾病,由于缺乏细胞修复机制,早期牙釉质龋的发展和逆转取决于牙体硬组织周围的物理化学过程(再矿化)。我们前期体外研究发现Amelogenin生物活性合成肽具有促进早期牙釉质龋损生物仿生再矿化行为。目的:本课题是在前期的研究基础之上,拟运用等温滴定量热仪、透射电子显微镜、傅立叶转换红外光谱、免疫荧光显微镜等对Amelogenin生物活性合成肽调节早期牙釉质龋生物仿生再矿化行为机制进行初探,为研发具有促进早期牙釉质龋仿生再矿化作用的制剂提供实验依据。方法:Amelogenin生物活性合成肽含猪釉原蛋白的N末端和C末端氨基酸残基,由Synpeptide Co Ltd公司使用标准固相肽合成法合成。1.Amelogenin生物活性合成肽与钙结合的实验:等温滴定量热法用于检测Ca~(2+)与Amelogenin生物活性合成肽之间的结合性能。1.25mM的CaCL_2溶液在PH=7,T=37℃,搅拌转速为400r/min条件下滴定0.12mM合成肽溶液,滴定数据采用Nano分析软件进行“independent“模式拟合分析,从而得出两者之间的结合常数(KD)、化学计量比(N)、反应焓(ΔH)和反应熵(ΔS)。2.Amelogenin生物活性合成肽对钙磷化合物生成的影响实验:实验分为四组:不含多肽溶液组(对照组);50ug/ml多肽溶液组;200ug/ml多肽溶液组;500ug/ml多肽溶液组。等分的CaCL_2和PH调节过的KH_2PO_4溶液依次加入到各组溶液中。TEM和SAED分别在15min,45min,4h,24h反应时间对其产物进行表征,FT-IR对24h最终矿化产物进行鉴定。3.Amelogenin生物活性合成肽对脱矿牙釉质渗透能力实验:牛牙釉质块在脱矿溶液中脱矿三天之后,放入含50ug/ml Amelogenin生物活性合成肽的再矿化溶液中再矿化12天。制备好的仿生再矿化釉质块进行间接免疫荧光染色、拍照,观察Amelogenin生物活性合成肽在釉质块内部的分布情况。结果:1.Amelogenin生物活性合成肽与Ca~(2+)可通过离子形式结合,结合常数为9.915×10~4M~(-1),反应化学量约为1mol的Ca~(2+)与1mol的多肽结合。2.所有浓度Amelogenin生物活性合成肽组均可通过结合形成稳定无定型磷酸钙的形式,抑制钙磷过早转化形成磷酸钙晶体,而不含多肽对照组迅速发生磷酸钙自发性沉淀反应。各组多肽溶液稳定形成无定型磷酸钙抑制晶体过早形成的能力表现为:50ug/ml组200ug/ml组500ug/ml组。且24小时最终产物中,对照组为随机排列的羟基磷灰石,而50ug/ml和200ug/ml多肽溶液组矿化产物为高度有序排列的羟基磷灰石晶体,500ug/ml多肽组仍为有序排列的无定型磷酸钙纳米颗粒。3.仿生釉质块的表层及表层下均能观察到Amelogenin生物活性合成肽的分布。结论:1.Amelogenin生物活性合成肽具有与Ca~(2+)结合的能力,具备Ca~(2+)携带器的功能。2.Amelogenin生物活性合成肽通过结合形成稳定无定型磷酸钙,抑制钙磷过早转化形成磷酸钙晶体,可维持饱和溶液中生物可利用的钙磷,且这种作用随着多肽浓度变化而变化,同时Amelogenin生物活性合成肽具有调节形成高度有序排列的羟基磷灰石晶体能力。3.Amelogenin生物活性合成肽可渗透进入龋损深部的脱矿区域。
【图文】：

再矿化,脱矿,动态过程

2图1 脱矿与再矿化动态过程图现代牙科学的一个重要目标就是在不可逆龋洞形成之前通过保守的非手术性的手段，以达到终止龋病的发展、恢复牙齿的美观、抗力及功能。目前国内外通过再矿化促进牙釉质早期龋损的修复方法可分为两大类：氟制剂处理技术和非氟制剂处理技术。迄今为止，氟化物是公认的治疗早期牙釉质龋最有效的再矿化方法[6, 7]。研究表明，氟制剂的再矿化是通过基于残余晶体的延长生长形成氟磷灰石而实现的[8, 9]。但是，由于氟化物缺乏指导调控矿物晶体形成的能力，在生理条件下，其很难在脱矿的牙釉质中形成有序的多等级矿物晶体[9]。成熟的牙釉质主要由具有多等级结构的羟基磷灰石晶体组成，，这种多等级的结构对于牙釉质的机械性能是必不可少的[10]。因此，理想的再矿化材料应尽可能地模拟形成釉质晶体高度有序的矿物结构以恢复牙釉质的性能。非氟制剂处理技术酪蛋白磷酸肽临床效果尚存争议

氨基酸序列,合成肽,釉原蛋白,生物活性

Amelogenin 生物活性肽的氨基酸序列，即MPLPPHPGHPGYINFSPYEVLTPLKWYQNMIRHPYTSYGYEPMGGWATDKTKREEVD（如图1.1所示）；本研究所用Amelogenin生物活性合成肽是委托上海杰肽生物科技有限公司（Synpeptide Co Ltd）合成。图1.1 全长猪釉原蛋白和实验所用Amelogenin生物活性合成肽的氨基酸序列冻干的Amelogenin生物活性合成肽称重，4°C条件下超声振荡器振荡48小时，确保其完全溶解于去离子水中。Amelogenin生物活性合成肽溶液在使用之前，高速离心机11340g，4℃下离心20分钟(目的是去尘和微粒杂质)。2.2 主-客体滴定，收集数据0.12mM（1ml）的Amelogenin生物活性合成肽溶液（含10mM HEPES）注入样品池中，参比池注入蒸馏水，1.25mM（240ul）的CaCL2溶液注入针管中，并在PH=7
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R781.1

【参考文献】