【摘要】：目的:探讨不同浓度BMP-2及BMP-9对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响,并进一步探讨在炎性因子TNF-α加入的情况下,不同浓度的BMP-2及BMP-9所介导的大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的改变,初步了解在炎性条件下,BMP-2及BMP-9对于成骨分化的作用效果。材料与方法:1、细胞提取、培养及鉴定:采用全骨髓冲洗及差速贴壁法分离培养SD大鼠原代骨髓间充质干细胞,流式细胞仪鉴定干细胞表面标记物,成脂及成骨分化验证其多向分化能力2、实验分组:实验以在诱导成骨培养基(Osteogenic media OM)中培养的大鼠BMMSCs为对照组,以在OM中加入不同浓度BMP-2、BMP-9及TNF-α为实验组。浓度分别设定为(1)BMP-2浓度(50、100、150ng/ml)(2)BMP-9浓度(50、100、150ng/ml)(3)TNF-α浓度(10ng/ml)(4)TNF-α(10ng/ml)+不同浓度BMP-2(50、100、150ng/ml)(5)TNF-α(10ng/ml)+不同浓度BMP-9(50、100、150ng/ml)。3、碱性磷酸酶活性检测:AKP试剂盒测定各组碱性磷酸酶活力4、钙结节含量检测:茜素红染色矿化结节观察各组钙结节矿化程度。5、Real-Time PCR检测:检测各组成骨相关指标的ColⅠ、OCN mRNA的表达量6、统计学分析:采用统计软件SPSS 23.0软件分析,实验结果以均数±标准差(?x±s)表示,各组间比较采用LSD-t检验,以P0.05为显著性检验标准,作为差异有统计学意义,将分析检验后的实验数据应用GraphPad Prism 6.0进行制图。结果:1、细胞提取、培养及鉴定:经流式细胞仪鉴定提取的干细胞表面标记物CD29、CD34、CD44、CD45的阳性表达率分别为100%、2.9%、96.5%、0.8%,茜素红矿化结节染色及油红O成脂染色证实细胞有多向分化能力。2、ALP活性检测结果:与对照组相比,在加入含TNF-α的成骨诱导液进行培养后,在第3、5、7天各时间点,BMMSCs碱性磷酸酶的活性显著降低(P0.05)在加入含BMP-2及BMP-9的成骨诱导液进行培养后,BMMSCs碱性磷酸酶活性有明显提升(P0.05),并且均在BMP-2及BMP-9浓度为100ng/ml时达到峰值。且含BMP-9的培养液所诱导的BMMCs的碱性磷酸酶活性均高于同等浓度的BMP-2。在同时含有BMP-2、BMP-9及TNF-α((4)组、(5)组)的成骨诱导培养液中,BMMSCs碱性磷酸酶活性均较同浓度仅含有BMP-2、BMP-9的诱导培养液所诱导的结果偏低,但高于对照组及TNF-α组(P0.05)。3.茜素红钙结节染色结果:与对照组相比,在按实验分组加入不同浓度TNF-α、BMP-2、BMP-9的成骨诱导液培养14天后,仅含TNF-α成骨诱导培养液组的钙结节含量减少(P0.05),含有BMP-2及BMP-9成骨诱导培养液组钙结节含量显著提升,且含BMP-9诱导培养液组的钙结节含量高于同浓度的BMP-2组(P0.05),在加既含有BMP-2、BMP-9及TNF-α((4)组、(5)组)的诱导成骨培养液培养14天后其钙结节含量较仅含BMP-2、BMP-9组的含量降低,但依旧高于对照组及TNF-α组(P0.05)4.实时定量PCR结果:与对照组相比,成骨晚期相关指标OCN的mRNA表达量,在按实验分组加入不同浓度的TNF-α、BMP-2、BMP-9的成骨诱导液培养21天后,仅含TNF-α组的含量远低于对照组,含有BMP-2及BMP-9组的OCN的mRNA表达量随着浓度增加而增加,且在100ng/ml浓度时达到峰值,与浓度达到150ng/ml表达量无显著差异(P0.05)同浓度的BMP-9所诱导成骨后OCN的表达量依旧高于同浓度BMP-2(P0.05)。在(4)组、(5)组浓度的诱导液培养21天后OCN的表达量与同浓度仅含BMP-2及BMP-9的培养液相比降低(P0.05)但高于对照组及仅含TNF-α组。Ⅰ型胶原ColⅠ的表达量呈现相同的趋势。结论:BMP-2及BMP-9对于BMMSCs有明显的促成骨作用,且有随浓度增加而增加的趋势,但二者都会在其浓度达到100ng/ml时达到促成骨作用的峰值,且BMP-9的促成骨作用(ALP值、钙结节面积、OCN及ColⅠ的表达量),均高于同浓度的BMP-2,在炎性因子TNF-α的作用下BMMSCs成骨分化受到了抑制,对于BMP-2及BMP-9所介导的成骨分化同样起着抑制作用,但BMP-9依旧能在炎性因子的作用下发挥着比同浓度BMP-2更好的成骨作用。且其最佳促成骨浓度也因炎性因子的作用而上升。
【图文】：
中国医科大学硕士学位论文3 结果3.1 BMMSCs 提取、培养初接种于培养皿中的的细胞成球形，与红细胞等其他杂质细胞无法明显区24h 换液后细胞贴壁变形，伸出伪足，呈现多边形或梭形。在第 5d 左右出现细落，经过 TryPLE Express消化后传一代后，杂质细胞数量明显减少，细胞形态一。生长速度逐步加快，在 5d左右即可达到 80%左右的融合度。后逐步培养传代，第三代 BMMSCs细胞形态统一，生长速度良好，约 3~4d可达到 80%融合可用于进一步实验
3.3 BMMSCs 多向分化能力检测第 3 代 BMMSCs 在成骨诱导培养基培养 7d 左右，显微镜下可见大小不等的结晶状团块，即为早期形成的钙化结节或其分泌基质，，在培养至第 14d 结晶状团块逐渐增大。在诱导成骨过程中 BMMSCs 增殖速度明显减缓，换液的过程中见有少量结节脱落漂浮于培养基之中。经异丙醇固定及茜素红 S 染色液染色后，可见明显的被染成红色的钙化结节（如图 3）。第 3代 BMMSCs更换诱导成脂培养基进行培养后，细胞形态逐步发生改变，生长速度缓慢并在换液过程中少量细胞漂浮，细胞胞质内逐步出现类似液滴状结构，此为脂肪细胞的脂滴。在诱导 14d 后多聚甲醛固定异丙醇清洗后，油红 O染色脂滴观察到脂肪滴被染成橙红色（如图 4）图 2. BMMSCs 表面标记物流式细胞仪检测结果
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R78
【参考文献】
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本文编号：
2642231
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