骨髓间充质干细胞通过CXCL8归巢至口腔鳞状细胞癌的机制研究

发布时间：2020-05-03 20:44

【摘要】：研究目的:骨髓间充质干细胞(BMSCs)可以趋化至多种类型的肿瘤微环境,被认为具有靶向载药的潜能,但BMSCs对口腔鳞癌是否具有趋化作用,以及BMSCs对口腔鳞癌趋化的机制并不清楚,因此本研究将探究BMSCs对口腔鳞癌的趋化作用及其内在的机理机制。研究方法:1、将复苏后的BMSCs用流式抗体标记,利用流式细胞术检测其表面受体,确定BMSCs的纯度。2、免疫组织荧光染色检测BMSCs在口腔鳞癌组织内的分布浸润情况。收集不同细胞的上清液作为条件培养基(conditional media,CM),trans-well共培养体系检测不同CM对BMSCs的趋化作用。Real-Time PCR方法检测相关细胞趋化因子(CCL2、CCL3、CCL5、CXCL1、CXCL8、CXCL16)和趋化因子受体(CXCR1、CXCR2)的表达;ELISA检测CXCL8趋化因子的分泌情况;加入抑制剂后检测BMSCs的趋化作用。3、对新型纳米材料金纳米簇(AuNC)进行物理、化学及生物安全性检测后,AuNC体外标记BMSCs,利用Ca127建立裸鼠移植瘤模型,尾静脉注射标记后的BMSCs,小动物活体成像、冰冻切片分别从不同层次观察BMSCs的趋化情况。研究结果:1、复苏后的BMSCs传代培养至第二代,形态稳定,倒置显微镜观察可见:BMSCs呈长梭形,胞质丰富,细胞核呈椭圆形或肾形,细胞突向两侧伸展,细胞排列密集呈放射状。流式细胞术检测BMSCs的细胞表型结果显示:BMSCs特异性抗原CD90、CD105和CD44高表达,造血系抗原CD45和CD11b低表达。2、在口腔鳞癌组织内分布着大量的BMSCs,体外Trans-well实验显示与正常上皮细胞Hacat相比,Ca127和FaDu可明显趋化BMSCs。Real-time PCR显示在CCL2、CCL3、CCL5、CXCL1、CXCL8、CXCL16这些常见的趋化因子中CXCL8的mRNA表达量明显升高,ELISA检测细胞上清液结果显示与Hacat相比,Ca127和FaDu细胞可分泌大量趋化因子CXCL8。进一步检测BMSCs表面趋化因子受体可见CXCR2的mRNA表达较CXCR1明显较高。抑制CXCL8与其受体CXCR2结合后Trans-well结果发现趋化细胞数明显减少。3、在体内实验中,金纳米簇为一种2-3nm大小,红色荧光的低毒性材料,可高效标记BMSCs。裸鼠成瘤后尾静脉注射BMSCs,24h后小动物活体成像显示肿瘤部位可见明显荧光,而抑制剂组荧光在裸鼠体内弥散,无集聚。冰冻切片显示BMSCs组可见在肿瘤间质中出现大量标记的BMSCs,抑制剂组在肿瘤部位标记的BMSCs稀少。研究结论:口腔鳞癌可以经CXCL8-CXCR2途经募集骨髓中的BMSCs趋化至口腔鳞癌的肿瘤微环境。
【图文】：

２．２．１逦口腔淲癌组织内可见大量的ＢＭＳＣｓ来源细胞逡逑通过免疫组织荧光双染色ＢＭＳＣｓ的标志物ＣＤ１０５和上皮标志物Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ逡逑共定位，观察图２．１可以发现：ＯＳＣＣ内ＣＤ１０５＋的ＢＭＳＣｓ广泛分布，以Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ逡逑标记癌巢后，可见ＢＭＳＣ广泛分布于肿瘤间质中，，而在肿瘤实质中很少分布。逡逑ｕｉ逡逑ＣＤ１０５＋Ｅ－ｃａｄ逡逑图２．１免疫组织荧光染色检测ＢＭＳＣ的分布（１０ｘ１０）逡逑２．２．２逦ＢＭＳＣｓ表面受体检测逡逑复苏后的ＢＭＳＣｓ传代培养至第２代，形态稳定，倒置显微镜观察可见：逡逑ＢＭＳＣｓ多数细胞呈长梭形，胞质丰富，细胞核呈椭圆形或肾形，细胞突向两侧逡逑１１逡逑

表型结果显示：ＢＭＳＣｓ特异性ｂ表面抗原高表达：ＦＩＴＣ标记的ＣＤ９０：邋９９．９３％；逡逑ＦＩＴＣ标记的ＣＤ１０５：邋９２．６６％；邋ＰＥ标记的ＣＤ４４：邋９９．４７％；造血系抗原低表达：逡逑ＰＥ邋标记的ＣＤ４５：邋１．０１％邋和ＦＩＴＣ标记的ＣＤｌｌｂ：邋２．１１％邋（图２．２）。逡逑逦１■丨邋■邋｜邋｜逡逑９９．９３％逦｜邋９２．６６％逦９９．４７％邋Ｉ逡逑：Ｕ＿：ｌ邋Ｘ邋！■邋：ｌ邋—逡逑ｓ－＼逦２．１１％逡逑！；：逡逑图２．２流式细胞术检测ＢＭＳＣｓ细胞表面受体逡逑２．２．３体外ＢＭＳＣｓ归巢至□腔鳞癌细胞逡逑利用Ｔｒａｎｓ－ｗｅｌ丨共培养体系检测ＢＭＳＣ的归巢。荧光显微镜下观察可见，与逡逑空白对照组、正常上皮细胞组相比，Ｃａｌ２７组和ＦａＤｕ组可趋化更多的ＢＭＳＣｓ，且逡逑具有统计学意义，如图２．３所示。逡逑■：逦＇逦．逦？逦，：产逦５００１逦逦逦逦逡逑■嫊薇逦逦Ｔ逡逑ｉ邋？逦＿逡逑Ｈ－ＤＭＥＭ逦Ｈａｃａ．逦｜邋３00：逦■逡逑ＨＨ：ＨＨ邋ｚ邋0Ｕ邋ｓ邋■■丨逡逑Ｃａｌ２７逦ＦａＤｕ逡逑图２．３荧光显微镜观察ＢＭＳＣ细胞的归巢（２０ｘ１０）逡逑１２逡逑
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.8

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本文编号：2648097