L-精氨酸调控成牙骨质细胞凋亡及正畸牙根吸收的研究

发布时间：2020-05-05 02:08

【摘要】：在正畸治疗程中,牙根的吸收与修复往往伴随左右,当二者失衡时,则可能出现“正畸导致的炎性牙根吸收(Orthodontically induced inflammatory rootresorption,OIIRR)”。OIIRR具有高发性及难预测性的特点,但其发生机制及预防手段尚未明了。牙骨质的表面存在着大量成牙骨质细胞,其主要功能在于表达与矿化相关的蛋白,如骨钙素(Osteocalcin,OCN)、骨涎蛋白(Bone sialoprotein,BSP)等,分泌基质形成钙化结节和牙骨质。有文献报道在正畸治疗时,无论是牙根发生吸收抑或修复,成牙骨质细胞都处在激活的状态,这提示在受力时,成牙骨质细胞在牙骨质的破坏以及再生中都发挥着不可忽视的作用。近年来有文献报道,正畸作用力下牙周环境氧分压的下降导致成牙骨质细胞凋亡增加也可能是牙根发生吸收破坏的机制。有实验已证明,短暂的缺氧使成牙骨质细胞增殖活性下降,同时凋亡增加;虽伴有一过性矿化功能增强,但长时间缺氧后其矿化功能仍表现为降低。L-精氨酸(L-Arginine,L-arg)作为一氧化氮供体,有文献报道其可以增加组织和细胞的缺氧耐受性,抑制细胞的凋亡,促进包括成骨细胞在内的多种细胞的增殖及其功能活性。据此,在正畸治疗时牙周缺氧环境中,L-arg是否对成牙骨质细胞有同样的影响,从而减少正畸导致的牙根吸收,目前未见相关研究。本实验目的在于模拟正畸加力过程中牙周的局部缺氧环境,研究在低氧环境中L-arg对成牙骨质细胞增殖和凋亡的影响,并通过大鼠正畸牙移动模型的构建,在体内研究L-arg对牙齿加力过程中发生的牙根吸收的影响,以期为牙根吸收机制研究新方向提供证据,进一步指导临床治疗。本实验分为体外及体内两个部分:实验一:体外低氧环境下L-arg对成牙骨质细胞OCCM-30增殖及凋亡的影响。方法:在低氧环境中(2%O_2,5%CO_2,93%N_2)用含有不同浓度L-arg的培养基(0μmol/l,30μmol/l,60μmol/l,120μmol/l,240μmol/l,360μmol/l)培养OCCM-30,分别于24小时和48小时用CCK-8比色法检测细胞增殖情况,使用流式细胞仪检测细胞的凋亡水平。在低氧环境中选用含有L-arg浓度分别为0μmol/l和120μmol/l的培养基培养OCCM-30,48小时后,采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测Caspase-3、Caspase-9、Bax以及Bcl-2的基因表达,运用蛋白免疫印迹法(Western-blot)检测Caspase-3、Caspase-9、Bax以及Bcl-2的蛋白表达水平。结果:低氧环境下L-arg作用24小时后,CCK-8检测显示:L-arg浓度为0μmol/l时,OCCM-30细胞活力相比常氧环境的对照组明显下降,差异均具统计学意义(P0.05)。当L-arg的浓度为30μmol/l时,OCCM-30细胞的活力较0μmol/l时明显增加,差异均具统计学意义(P0.05),直至浓度为120μmol/l,细胞活力呈现上升达峰值,随后浓度增加,活力反而降低。流式细胞仪检测显示:L-arg浓度为0μmol/l时OCCM-30细胞凋亡率相比常氧环境中的对照组大幅上升,差异均具统计学意义(P0.05),当L-arg的浓度为30μmol/l,细胞凋亡率较0μmol/l时下降,差异均有统计学意义(P0.05),直至浓度为120μmol/l,细胞凋亡率下降至最低,随后浓度增加,细胞凋亡又增加。在48小时cck-8及流式细胞仪检测得到的趋势和24小时类似。低氧环境下培养48小时后,RT-PCR检测结果显示:未加入L-arg时,OCCM-30细胞中Caspase-3、Caspase-9、Bax因子的基因表达较常氧对照组均增加,L-arg浓度为120μmol/l时,表达较未加入时明显下降,差异具有统计学意义(P0.05);未加入L-arg时Bcl-2基因表达较常氧对照组减少,L-arg浓度为120μmol/l时,表达较未加入L-arg时明显增加,差异具有统计学意义(P0.05)。低氧环境下培养48小时后,Western-blot检测显示:未加入L-arg时,OCCM-30细胞中Caspase-3、Caspase-9、Bax因子的蛋白表达较常氧对照组增加,L-arg浓度为120μmol/l时,表达较未加入L-arg时下降;Bcl-2蛋白表达与上诉因子呈相反趋势。结论:低氧刺激会抑制OCCM-30增殖促进OCCM-30凋亡,L-arg可有效促进低氧环境中OCCM-30的增殖抑制低氧环境中OCCM-30的凋亡,且浓度为120μmol/l增殖水平达到峰值且凋亡水平降到最低。其机制可能与抑制了Caspase-3、Caspase-9、Bax基因和蛋白的表达并促进了Bcl-2基因和蛋白的表达有关。实验二:体内局部应用L-arg对大鼠正畸牙移动中牙根吸收的影响。目的:探究应用L-arg对在大鼠正畸牙移动中发生的牙根吸收的影响。方法:随机将36只8周龄健康的雄性SD大鼠平均分成3组,空白组、对照组(PBS组)、实验组(L-arg组)分别12只,在各组大鼠的左侧上颌的第一磨牙牙冠上施加大小为50 g方向为近中的力,隔天在左侧上颌第一磨牙的颊侧黏骨膜下注射每组对应的药物,对照组为PBS,对照组为L-arg,空白组只加力不注射任何药物。于第7、14?天处死大鼠,游离上颌骨,制备包含第一磨牙的牙槽骨标本,进行Micro-Computed Tomography(Micro-CT)扫描,数据导入Mimics19.0软件采用三维凸包法计算牙根根上1/3及根中1/3部分的吸收陷窝体积,并将标本包埋、切片后抗酒石酸酸性磷酸酶的染色(TRAP染色)、PCNA免疫组化染色以及TUNEL染色观察牙周组织中破骨细胞数目和牙周细胞的增殖凋亡情况。结果:加力7和14天后,三维凸包法计算结果显示:对照组和空白组吸收陷窝体积差异无统计学意义,实验组的吸收陷窝体积较相对照组组均减小,差异有统计学意义(P0.05);TRAP染色结果显示:对照组和空白组的破骨细胞计数差异无统计学意义,实验组相对于对照组差异无统计学意义;PCNA染色和TUNEL染色显示:实验组大鼠第一磨牙近中根的牙周组织压力侧近牙根的细胞中处于增殖状态的较对照组增加,而牙周组织凋亡的细胞百分率降低。结论:局部应用一定浓度的L-arg可以减少大鼠正畸牙移动过程中的牙根吸收。
【图文】：

低氧,细胞增殖,细胞活力,统计学意义

1.2.6 统计学分析用 SPSS20.0 软件对各组结果进行单因素的方差分析，P＜0.05 认为均数间比较具有统计学上的差异。2 结果2.1 CCK-8 检测低氧环境下 L-arg 对 OCCM-30 增殖水平的影响低氧环境下 L-arg 作用 24 小时以及 48 小时后，CCK-8 检测显示：L-arg 浓度为 0μ mol/ l 时，OCCM-30 细胞活力相比常氧环境的对照组明显下降，差异均具统计学意义( P＜0.05)。当 L-arg 的浓度为 30μ mol/ l 时，，OCCM-30 细胞的活力较0μ mol/ l 时明显增加，差异均具统计学意义( P＜0.05)，直至浓度为 120μ mol/l，细胞活力呈现上升达峰值，随后浓度增加，活力反而降低(如图 1 示)。

低氧,细胞凋亡,流式细胞仪,流式细胞仪检测

重庆医科大学硕士研究生学位论文Figure 1. Effects of different concentrations of l-arg on the proliferation of OCCM-30 oxia （compared with control group, *P<0.05；compared with 0μmol/l group #P<02 流式细胞仪检测低氧下 L-arg 对 OCCM-30 凋亡的影响流式细胞仪检测显示：L-arg 浓度为 0μ mol/ l 时 OCCM-30 细胞凋亡率相环境中的对照组大幅上升，差异均具统计学意义( P＜0.05)，当 L-arg 的 30μ mol/ l，细胞凋亡率较 0μ mol/ l 时下降，差异均有统计学意义( P＜0.至浓度为 120μ mol/l，细胞凋亡率下降至最低，随后浓度增加，细胞凋亡。在 48 小时 cck-8 及流式细胞仪检测得到的趋势和 24 小时类似（如图 2 示
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R783.5

【参考文献】