沉默IQGAP1对舌鳞癌细胞ERK基因表达及增殖、侵袭、迁移的影响

发布时间：2020-05-07 20:07

【摘要】：IQ结构域三磷酸鸟苷合酶激活蛋白1(IQ-domain GTPase-activating protein 1,IQGAPI)是一种高度保守的细胞质支架蛋白,能与100余种其他蛋白质结合的多功能支架蛋白,是多种信号通路的关键调控因子。IQGAP1具有两个紧密相关的家族蛋白IQGAP2和IQGAP3,它们具有不同的功能,但是IQGAP1是更广泛表达的蛋白质,IQGAP1涉及骨骼重组和调节细胞粘附,极性和迁移。IQGAP1还通过IQ域和通过富含脯氨酸的WW域对RAF和MEK进行调节,以调节RAF/MEK/ERK信号。研究表明IQGAP1是MAPK和Wnt/β-catenin信号通路的重要调节因子。在肿瘤发生和癌症进展中起关键作用。IQGAP1在食管鳞状细胞癌中高表达,而IQGAP1敲低可以在体外和体内降低细胞增殖和转移能力。同时,过表达IQGAP1的癌细胞中AKT和ERK磷酸化水平上调。但IQGAP1在舌鳞癌中作用及机制尚不清楚。本课题进行了关于IQGAP1及ERK在舌鳞癌中的相关性研究。通过qPCR检测IQGAP1及ERK在舌鳞癌细胞株CAL27、SCC25、SCC9细胞中的表达量,结果显示,IQGAP1及ERK均在舌鳞癌细胞株中高表达。而当沉默IQGAP1后,通过qPCR及Westerm Blot实验检测IQGAP1及ERK表达,发现IQGAP1及ERK在舌鳞癌细胞中表达下调;舌鳞癌细胞的增殖、侵袭、迁移均受抑制。第一章IQGAP1基因沉默有效si-RNA的筛选目的:筛选沉默IQGAP1基因的有效si-RNA序列,选择最优序列进行后续实验。方法:1.常规培养舌鳞癌细胞株CAL27、SCC25、SCC9细胞;2.qPCR检测IQGAP1及ERK在舌鳞癌细胞中的表达量;3.构建三个不同序列si-RNA,沉默IQGAPI基因,分别转染CAL27、SCC25及SCC9,qPCR实验检测沉默后各组细胞IQGAP1的表达量;4.CCK8增殖实验检测各组细胞增殖情况,根据各实验结果筛选最优序列进行后续实验。结果:1.IQGAP1在舌鳞癌细胞株中高表达,同时ERK在舌鳞癌细胞株中也表现为高表达;2.三个不同序列si-RNA沉默IQGAP1后,在CAL27、SCC25、SCC9细胞株中,IQGAP1均呈现低表达;3.在CCK8增殖实验中,三组细胞株中,三个不同序列si-RNA在不同时间段有不同程度差异,均有统计学意义,其中编码为si-RNA-3746序列在各组细胞株中均有差异,且其在SCC25中较为明显且稳定,选择si-RNA-3746及SCC25作为后续实验的最优序列及细胞株。第二章沉默IQGAP1基因对舌鳞癌细胞SCC25中ERK基因表达的影响目的:IQGAPI基因在舌鳞状细胞癌中呈现高表达,相应ERK基因也高表达。研究两者之间是否存在联系,当沉默IQGAP1基因,ERK基因表达是否降低。本实验通过沉默IQGAP1基因后检测ERK基因的表达,以验证两者的相关性。方法:1.沉默IQGAP1基因,以qPCR实验验证沉默IQGAP1基因后IQGAP1基因及ERK基因的表达水平;2.沉默IQGAP1基因,以Western Blot实验验证沉默IQGAP1基因后IQGAP1基因及ERK基因的表达水平。结果:1.沉默IQGAP1后,通过qPCR实验验证,结果显示SCC25细胞中IQGAP1基因表达量下降,同时ERK基因表达量也下降。2.沉默IQGAP1后,通过Wserern Blot验证,结果显示3CC25细胞中IQGAP1基因蛋白表达量下降,同时ERK基因蛋白表达量也下降。第三章沉默IQGAP1基因对舌鳞癌细胞SCC25的增殖、侵袭、迁移的影响目的:研究沉默IQGAP1基因后对舌鳞癌细胞SCC25的增殖、侵袭、迁移的影响。方法:1.沉默SCC25细胞IQGAP1基因;2.CCK8检测实验组及阴性对照组、空白对照组的细胞增殖情况;3.Transwell检测实验组及阴性对照组、空白对照组的细胞侵袭性的改变;4.Woundhealing检测实验组及阴性对照组、空白对照组的细胞迁移情况。结果:沉默SCC25细胞IQGAP1基因后,SCC25细胞的增殖性、侵袭性及迁移能力较对照组显著下降。全文总结1.IQGAP1与ERK基因在舌鳞癌细胞CAL27、SCC25、SCC9中高表达;2.当沉默SCC25细胞中IQGAP1基因时,ERK基因表达下调,癌细胞的增殖性、侵袭性、迁移能力下降;3.IQGAP1基因可能是舌鳞癌治疗的一个潜在新靶点。
【图文】：

（１．ＤＬ２０００；邋２．ＣＡＬ２７；邋３．ＳＣＣ９；邋４．ＳＣＣ２５）逡逑Ｃ２５及ＳＣＣ９邋ＲＮＡ电泳鉴定图，２８ｓ与１８ｓ条带２：１，可见ｍＲＮＡｓｍｅａｒ，５ｓ条带较弱。逡逑ＳＣＣ２５邋ａｎｄ邋ＳＣＣ９邋ＲＮＡ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｙ邋ｖｉｓｉｂｌｅ，邋ｔｈｅ邋ｒａｔｉｏ邋ｉｓ邋ａｂｏｕｔ邋２：１，邋ｖｉｓｉｂｌｅ邋ｍＲＮＡ邋ｓｍｅａｒ，ｐ－ａｃｔｉｎ；邋３．ＳＣＣ９，邋Ｐ－ａｃｔｉｎ；邋４．ＳＣＣ２５，邋ｐ－ａｃｔｉｎ；邋５．ＣＡＬ２７６．ＳＣＣ９，，邋ＩＱＧＡＰ１；邋７．ＳＣＣ２５，邋ＩＱＧＡＰ１）逡逑

逡逑图１－９沉默ＩＱＧＡＰ１后ＣＡＬ２７ｑＰＣＲ产物电泳图，卜ａｃｔｉｎ及ＩＱＧＡＰ１，条带清晰且无杂逡逑带，表明没有非特异性扩增和引物二聚体（ｐ－ａｃｔｉｎ：邋１７４ｂｐ；邋ＩＱＧＡＰ１：邋１７８ｂｐ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－９邋Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｍａｐ邋ｏｆ邋ＣＡＬ２７邋ｑＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔ邋ａｆｔｅｒ邋ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ邋ＩＱＧＡＰ１，邋Ｐ－ａｃｔｉｎ邋ａｎｄ逡逑ＩＱＧＡＰ１，邋ｂａｎｄ邋ｃｌｅａｒ邋ａｎｄ邋ｎｏ邋ｂａｎｄｓ，邋ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ邋ｎｏ邋ｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｐｒｉｍｅｒ邋ｄｉｍｅｒ．逡逑（Ｐ－ａｃｔｉｎ：邋１７４邋ｂｐ；邋ＩＱＧＡＰ１：邋１７８邋ｂｐ）逡逑２．４．２原始数据及计算结果逡逑表１－３原始数据及计算逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－３邋Ｒａｗ邋ｄａｔａ邋ａｎｄ邋ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ逡逑检测项目逦Ｎａｍｅ逦ＣＴ
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.86

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本文编号：2653487