Beagle犬脂肪干细胞促进牙周组织再生的实验研究

发布时间：2020-05-13 01:41

【摘要】： 慢性牙周炎(chronic periodontitis, CP)是牙齿支持组织,包括牙龈、牙骨质、牙周膜和牙槽骨因炎症所致的一种疾病,是人类口腔的两大类主要疾病之一,是导致成年人牙齿丧失的一个主要原因。目前CP的治疗效果仅限于控制病症,防止其进一步发展,然而对于因牙周病丧失的牙周组织难以再生。近年来的牙周组织工程的研究为丧失的牙周组织再生提供了可能,种子细胞、细胞因子和支架材料是牙周组织工程的三大要素。ZUK首先于2000年发现了脂肪干细胞,因其取材方便,再生能力强,在多种组织的再生中都有应用,但脂肪干细胞在牙周组织再生中的应用尚少;种子细胞需要细胞因子的诱导才能分化转归,富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)是全血经过离心、分离而得到的血小板浓缩物,富含由血小板分泌的七种与所有创伤愈合过程有关的蛋白生长因子,在种子细胞的分化转归中起到了很重要的作用;纳米羟基磷灰石/胶原是一种有机无机复合的支架材料,在牙周组织再生中起了促进作用。本课题研究Beagle犬的脂肪干细胞的获得,鉴定及向成骨细胞转化,研究其增殖分化过程中,PRP的作用,及脂肪干细胞与支架材料纳米羟基磷灰石/胶原的生物相容性,为牙周组织工程筛选合适的种子细胞、细胞因子和支架材料组合提供实验依据;并将脂肪干细胞-PRP-纳米羟基磷灰石/胶原复合物移植到动物实验牙周缺损处,观察该模式对牙周组织再生的作用。目的:观察脂肪干细胞的分离培养鉴定的方法及其向成体细胞转化的能力,在脂肪干细胞矿化过程中观察PRP对其矿化的影响,及脂肪干细胞与支架材料的生物相容性,研究脂肪干细胞-PRP-纳米羟基磷灰石/胶原复合物对牙周组织再生的作用。探索脂肪干细胞作为牙周组织工程的种子细胞的可行性,为牙周组织工程筛选合适的种子细胞,细胞因子和支架材料提供实验依据。方法:酶消化法培养Beagle犬脂肪干细胞,用免疫组化SP法检测CD44、CD29表达,鉴定其干细胞特性;将用改良法获得的不同浓度的PRP作用于Beagle犬脂肪干细胞,观察促进Beagle犬脂肪干细胞增殖的最佳浓度;将获得的脂肪干细胞分别采用含100 mL/L FBS的DMEM培养液、成骨细胞诱导液和添加PRP的成骨细胞诱导液培养脂肪干细胞,21天后经Von Kossa染色,观察脂肪干细胞向成骨细胞分化的能力及分化过程中PRP的作用;将脂肪干细胞与纳米羟基磷灰石/胶原共培养7天,环境扫描电镜观察细胞在支架材料上的附着情况;将脂肪干细胞-PRP-纳米羟基磷灰石/胶原复合物移植到动物实验牙周缺损处,分别于4W,8W,12W处死动物,观察该复合物对牙周组织再生的作用。结果:1、酶消化法能够成功获得脂肪干细胞,经CD44、CD29鉴定其间充质干细胞来源; 2、培养液中所含血小板浓度为全血浓度的1.5倍时,PRP促进脂肪干细胞的增殖作用最佳; 3、在成骨细胞诱导液的诱导下,原代培养的脂肪干细胞能够向成骨细胞转化,形成钙化结节,PRP能够有效的促进钙化节结的形成. 4、细胞与支架材料复合培养7天后,细胞能够与支架材料复合生长,附着紧密,伸展充分。结论:1、脂肪干细胞取材方便,成活率高,增殖能力强,在矿化液诱导下,能向成骨细胞转化,可以作为牙周组织工程良好的种子细胞; 2、PRP能够促进脂肪干细胞的增殖,促进该细胞向成骨细胞分化,是牙周组织工程良好的细胞因子; 3、纳米羟基磷灰石/胶原与脂肪干细胞的生物相容性良好,能够作为牙周组织工程的支架材料; 4、脂肪干细胞-PRP-纳米羟基磷灰石/胶原是促进牙周组织再生良好的组合。
【图文】：

体外分离,干细胞,脂肪,免疫组化染色

图 1 体外分离培养犬脂肪干细胞。倒置显微镜下观察。Fig 1 Explant and culture of ADSCs. Observation from inversion microscopeFig 1-1 passage 1 culture 24 hours 100×Fig 1-2 passage 1 culture 48 hours 200×Fig 1-3 passage 3 culture 24 hours 200×Fig 1-4 passage 4 culture 72 hours, bespread all the bottom of cell flask. 100×3.2 Beagle 犬脂肪干细胞的鉴定Beagle 犬 ADSCs 的 CD44，CD29 免疫组化染色分别见图 2。由图可见，CD44、CD29 的免疫组化染色均阳性，为细胞质染色，每个切片随机选择 10 个视野，照相，利用捷达图像分析软件，约 80%细胞 CD44、 CD29 阳性.证明所培养的细胞，具有间充质干细胞的特性。

干细胞,脂肪,免疫组化染色

图 2 脂肪干细胞 CD44 CD29 免疫组化染色Fig 2 iummuochemical stain of ADSCs for CD44 CD29 Observation by optical microscope.Fig 2-1 CD44 iummuochemical stain 100×Fig 2-2 CD44 iummuochemical stain 200×Fig 2-3 CD29 iummuochemical stain 100×Fig 2-4 CD29 iummuochemical stain 200×3.3 PRP 的计数及瑞氏染色同一只 Beagle 犬相同体积的血液，相同方法进行 2 次 PRP 制备，制备前均用血球计数板计数，两次计数结果分别为 289.1×109个/L 和 288.2×109个/L，平均为 288.65×109个/L。富血小板血浆制成后见图 1-1，中间灰白色层即为血小板和白细胞层，两次 PRP 制备后的血小板计数分别为 3501×109个/L 和 3504×109个/L，，平均值为 3502.5×109个/L，浓缩 12 倍，可见该方法能够有效的浓缩血小板，
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R781.4

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