【摘要】：背景和目的口腔鳞状细胞癌(OSCC,oral squamous cell carcinoma)是口腔恶性肿瘤中发病率最高的类型,约占口腔恶性肿瘤的90%。即使医学技术在不断发展,OSCC患者的死亡率仍然处于较高的水平。统计数据显示,其患病群体趋于年轻化,总体预后差,5年生存率低于50%。研究开发高效、低毒性的抗OSCC药物具有非常重要的临床意义。桑色素(Morin,3,5,7,2',4'-pentahydroxyflavone)是从桑科植物中提取的一种浅黄色黄酮类化合物。多种黄酮类化合物已在研究中被证实,具有潜在药用价值。Morin可以通过参与调节细胞的多条信号通路发挥其抗氧化、抗炎、抗菌及抗肿瘤等重要的生理作用。研究证实,Morin作为具有生物活性的化合物,具有广泛的药理活性和极低的细胞毒性。探讨Morin对OSCC细胞生物学行为的调控作用及分子机制,有助于为研究开发针对OSCC的抗肿瘤药物提供理论基础。Hippo通路是细胞内参与调节细胞多项生理活动的高度保守的信号通路。Hippo信号通路的激活,可以通过磷酸化YAP使其限定在胞质内,使YAP被泛素化作用降解;Hippo信号通路失活,会导致YAP磷酸化水平降低和胞核富集,从而影响其下游多种靶基因的转录活性,对细胞的生物学行为起到调控作用。YAP蛋白作为转录共激活因子,参与调控与细胞增殖、凋亡、分化相关的生物信号,在肿瘤的发生发展中具有重要作用。YAP蛋白水平的提高和胞核富集,可以诱导多种肿瘤的发生发展。Morin作为具有重要抗肿瘤活性的化合物,其对OSCC细胞调控作用的相关研究非常有限,且其在肿瘤细胞中发挥作用的分子机制也有待深入探讨。因此,本研究旨在探讨Morin对OSCC细胞生物学行为的调控作用,并探究Morin对OSCC所发挥的调节活性中,是否存在Hippo信号通路的介导。本实验首先检测了正常口腔上皮细胞和OSCC细胞对Morin敏感性的差异;其次,检测了Morin在OSCC细胞多项生物学行为中的调控作用;并探讨了 Hippo通路在Morin对OSCC细胞调节活性中的介导作用;以期为进一步探究Morin在肿瘤治疗方面的潜力和机制提供一定的理论基础,为开发、研究针对OSCC的治疗药物提供新的思路。材料和方法选择口腔鳞状细胞癌细胞系Ca127和SCC15作为研究对象,探讨Morin对OSCC细胞生物学行为的调控作用及其潜在机制。1.Morin对正常口腔上皮细胞(HOEC)和OSCC细胞的细胞毒性作用比较分别用Morin处理HOEC和OSCC细胞,以DMSO(二甲基亚砜)处理的细胞作为对照。用CCK-8法,检测Morin对HOEC和OSCC的细胞毒性,并计算Morin在HOEC和OSCC细胞中的IC50;Western blot检测Morin对HOEC和OSCC细胞ERK激活水平的影响。2.Morin对OSCC细胞生物学行为的调控作用(I)Morin分别处理Ca127、SCC15细胞,以DMSO处理作为对照:检测Cal27、SCC15细胞的克隆形成能力、EdU着色能力。(2)Morin分别处理Ca127、SCC15细胞,以DMSO处理作为对照:流式细胞术检测Ca127、SCC15的细胞周期分布和凋亡水平;Weestern blot检测Ca127、SCC15细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子P53、P21,凋亡相关蛋白CASPASE-3、CASPASE-9、BCL-2 的表达水平。(3)Morin分别处理Ca127、SCC15细胞,以DMSO处理作为对照:划痕实验检测Ca127、SCC15的迁移能力;Western blot检测Ca127、SCC15上皮-间质转化相关的标志蛋白E-CADHERIN、VIMENTIN的表达水平。(4)裸鼠体内成瘤实验:生长状态良好的裸鼠20只,随机分为A、B两组,每组10只,分别于裸鼠皮下注射Ca127、SCC15细胞构建裸鼠体内成瘤模型。A、B两组裸鼠分别随机分为A1、A2、B1、B2组,每组5只,连续25天:A1、B1组裸鼠经尾静脉注射50mg/kg Morin,每日1次;A2、B2组裸鼠经尾静脉注射与A1、B1组等剂量DMSO,每日1次。正常饲养25天后,处死裸鼠,剥离肿瘤,瘤体称重、拍照。3.Hippo通路介导Morin对OSCC细胞生物学行为调控作用的机制研究(1)Morin分别处理Ca127、SCC15细胞,以DMSO处理作为对照:①Western blot检测通路中关键激酶MST1、MOB1蛋白表达水平和磷酸化水平,②Western blot检测通路的关键效应因子YAP蛋白的磷酸化水平,及其分别在细胞质、细胞核内的表达水平,③免疫荧光染色检测YAP蛋白胞质胞核的亚细胞定位情况,④RT-PCR检测通路下游靶基因Ctgf、Cyr61、Ankrd的mRNA表达水平。(2)构建干扰和过表达Yap的Ca127、SCC15细胞,①EdU染色检测细胞的增殖能力,②流式细胞术检测细胞的周期分布和凋亡水平,③划痕实验检测细胞的迁移能力。(3)构建干扰MST1的Ca127、SCC15细胞,①Western blot检测phospho-MST1、phospho-MOB1、phospho-YAP、cytoplasmic-YAP、nuclear-YAP的蛋白表达水平,②Morin处理感染病毒后的OSCC细胞,分为OSCC+DMSO组、OSCC+Morin组、LV3-ctrl-OSCC+Morin组、LV3-shMstl-OSCC+Morin组:EdU染色检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞的周期分布和凋亡水平;划痕实验检测细胞的迁移能力;Western blot检测细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子P53、P21,凋亡相关蛋白CASPASE-3、CASPASE-9、BCL-2,上皮-间间质转化相关的标志蛋白E-CADHERIN、VIMENTIN的表达水平。结果1.Morin对HOEC和OSCC的细胞毒性作用比较(1)与对照组相比,Morin对HOEC、Cal27、SCC15细胞均产生增殖抑制作用,该抑制作用存在Morin剂量依赖性,且Morin的半数抑制浓度在正常口腔上皮细胞显著高于OSCC细胞。(2)与对照组相比,Morin对HOEC、Ca127、SCC15细胞phospho-ERK表达均有抑制作用,对phospho-ERK起到显著抑制作用的药物浓度,在Ca127和SCC15细胞中显著低于HOEC细胞。2.Morin对OSCC细胞生物学行为的调控作用(1)Morin处理Ca127、SCC15细胞,与对照组相比:OSCC细胞克隆形成能力、EdU着色阳性率显著降低。(2)Morin处理Ca127、SCC15细胞,与对照组相比:OSCC细胞周期出现G1期阻滞,P53、P21的蛋白表达水平显著上调;细胞的凋亡水平增加,凋亡蛋白CASPASE-3、CASPASE-9的蛋白表达水平显著上调,抑凋亡蛋白BCL-2的蛋白表达水平显著下调。(3)Morin处理Cal27、SCC15细胞,与对照组相比:OSCC细胞迁移能力显著下降,黏附因子E-CADHERIN表达显著上调、间质表型的标志蛋白VIMENTIN表达显著下调。(4)裸鼠皮下移植OSCC细胞后,尾静脉注射Morin组与尾静脉注射DMSO组相比,OSCC细胞在裸鼠体内形成的瘤体平均重量显著降低。3.Hippo通路介导Morin对OSCC细胞生物学行为调控作用的机制研究(1)Morin处理Ca127、SCC15细胞,与对照组相比:MST1、MOB1总蛋白表达水平不变,MST1、MOB1、YAP蛋白磷酸化水平升高,cytoplasmic-YAP蛋白表达水平升高,nuclear-YAP蛋白表达水平下降;Ctgf、Cyr61、Ankrd的mRNA表达水平下调。(2)干扰YAP的Ca127、SCC15细胞,与对照组细胞相比:增殖能力下降,细胞周期发生阻滞,细胞凋亡水平上调,细胞的迁移能力下降;过表达YAP的Cal27、SCC15细胞,与对照组细胞相比:增殖能力增强,细胞周期加速,细胞凋亡水平下调,细胞的迁移能力增强。(3)①干扰MST1的Cal27、SCC15细胞,与对照组细胞相比:MST1、MOB1、YAP的磷酸化水平降低,cytoplasmic-YAP蛋白水平降低,nuclear-YAP蛋白水平升高;②Morin处理感染病毒后的OSCC细胞,分为OSCC+DMSO组、OSCC+Morin 组、LV3-ctrl-OSCC+Morin 组、LV3-shMstl-OSCC+Morin 组:LV3-shMstl-OSCC+Morin组较OSCC+Morin组和LV3-ctrl-OSCC+Morin组,显著逆转了Morin处理OSCC细胞后EdU着色阳性率、细胞周期分布、细胞凋亡水平及细胞迁移能力的变化。③Morin处理感染病毒后的OSCC细胞,分为OSCC+DMSO 组、OSCC+Morin 组、LV3-ctrl-OSCC+Morin 组、LV3-shMstl-OSCC+Morin组:LV3-shMstl-OSCC+Morin组较OSCC+Morin组和LV3-ctrl-OSCC+Morin组,显著逆转了Morin处理OSCC细胞后相关蛋白表达水平的变化。结论1.Morin对HOEC、OSCC细胞均有细胞毒性作用,与正常口腔上皮细胞相比,OSCC细胞对Morin敏感性更强。2.Morin对OSCC细胞生物学行为存在调控作用,具体表现为抑制OSCC细胞增殖、阻滞细胞周期、促进细胞凋亡、抑制细胞迁移,抑制细胞在裸鼠体内成瘤能力。3.Morin在OSCC细胞中上调Hippo信号通路的磷酸化水平,下调关键效应因子YAP蛋白在细胞核内的表达水平。Hippo通路的关键效应因子YAP对OSCC细胞的生物学行为的具有重要的调控作用。干扰MST1,抑制了Hippo通路磷酸化水平,显著逆转了Morin对OSCC细胞的调控作用,从而证实了Morin对OSCC细胞的调控活性中Hippo通路的重要介导作用。
【图文】：
图１－１．邋Ｍｏｒｉｎ对ＨＯＥＣ和ＯＳＣＣ细胞的毒性作用比较逡逑Ａ：邋Ｍｏｒｉｎ处理Ｃａｌ２７细胞４８ｈ、７２ｈ，细胞增殖能力ＣＣＫ－８检测结果逡逑Ｂ：邋Ｍｏｒｉｎ处理ＳＣＣ１５细胞４８ｈ、７２ｈ，细胞增殖能力ＣＣＫ－８检测结果逡逑Ｃ：邋Ｍｏｒｉｎ处理ＨＯＥＣ细胞４８邋ｈ、７２邋ｈ，细胞增殖能力ＣＣＫ－８检测结果逡逑＊：邋ｐＣＯ．ＯＳｗＤＭＳＯ邋组逡逑
图２－１．邋Ｍｏｒｉｎ对ＯＳＣＣ细胞克隆形成能力的影响逡逑Ａ：邋Ｍｏｒｉｎ处理两周后，Ｃａｌ２７、ＳＣＣ１５细胞的克隆形成情况逡逑Ｂ：邋Ｍｏｒｉｎ处理两周后，，Ｃａｌ２７、ＳＣＣ１５细胞克隆形成数目的量化分析逡逑ｊＤ＜０．０５ｗＤＭＳＯ邋组逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.8
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