Klf4在小鼠成牙本质细胞分化中的作用

发布时间：2020-05-13 16:29

【摘要】：一、它莫西芬诱导型可逆永生化小鼠牙乳头细胞系的建立和鉴定 研究目的：成牙本质细胞是一种可分泌矿化基质的终末分化细胞,在牙髓牙本质复合体中发挥重要作用。小鼠牙乳头细胞(mDPCs)在体外诱导条件下可分化成成牙本质细胞样细胞。但是由于繁琐的原代培养过程和细胞有限的寿命,在实验过程中不易获得稳定的细胞来源。为解决该问题,本研究将传统的基于Cre/LoxP的可逆永生化系统与它莫西芬诱导的Cre重组酶系统相结合,试图建立一个它莫西芬诱导型可逆永生化小鼠牙乳头细胞系,并对其进行鉴定。 研究方法：首先使用慢病毒介导的方法将已插入LoxP位点的SV40Tag-TK表达载体转染入原代培养的mDPCs。经过GCV筛选和单克隆筛选获得一个稳定表达SV40Tag并持续增值的克隆-mDPC6T,进而在mDPC6T过表达含有雌激素受体的ERT2CreERT2重组酶。经单克隆筛选SV40Tag和Cre阳性细胞,获得细胞系mDPCET。 mDPCET经过4-羟基它莫西芬(4-OHT)处理后获得逆永生化细胞。通过EdU掺入实验和PDLs计数法检测原代mDPCs、mDPCET和逆永生化细胞的细胞增殖动力学,通过免疫荧光、Real-time RT-PCR和Western Blot检测成牙本质相关标志物,茜素红染色检测细胞在诱导条件下矿化结节的形成。 研究结果：与原代细胞相比,mDPCET增殖能力显著上调,寿命延长,但是同时保持了原代mDPCs的大部分生化和功能特性,当mDPCET细胞在4-OHT处理条件下,ERT2Cre ERT2从细胞质转移到细胞核,从而敲除已转入的SV40Tag-TK,使mDPCET发生逆永生化。与mDPCET相比,逆永生细胞的成牙本质相关基因及矿化结节形成能力显著上调,并重新获得可发生复制性衰老的能力。 结论：建立并鉴定了一个它莫西芬诱导型可逆永生化小鼠牙乳头细胞系mDPCET。经4-OHT处理后,mDPCET可发生逆永生化,逆永生化细胞呈现低增殖高分化的状态,并重获可衰老的能力,这种状态更加类似分化的成牙本质细胞。 二、Klf4通过调控Dmp1促进小鼠牙乳头细胞向成牙本质细胞样细胞分化 研究目的：成牙本质细胞来源于牙乳头,是一种具有分泌基质功能的终未分化细胞。在成牙本质细胞分化过程中多种转录因子参与了调控。本课题组过去的研究发现,Kruppel-like factor4(Klf4)特异性表达在极化和延伸期的成牙本质细胞中,但是Klf4在成牙本质细胞分化过程中的作用尚不明确。本研究试图探索Klf4在成牙本质细胞分化过程中的功能,并分析其调控成牙本质细胞分化的分子机制。 研究方法：在本研究中,使用矿化诱导液在体外诱导小鼠原代牙乳头细胞(mDPCs)和小鼠牙乳头细胞系即mDPC6T向成牙本质细胞样细胞分化作为研究模型。检测诱导过程中Klf4的mRNA和蛋白质表达水平、碱性磷酸酶活性和成牙本质细胞分化相关基因(Dspp、Dmp1和Alp)的表达：同时通过EdU掺入法检测细胞的增殖能力。在Klf4过表达和抑制条件下检测成牙本质细胞分化相关基因(Dspp、Dmp1和Alp)的表达和碱性磷酸酶活性,同时通过EdU掺入法检测细胞的增殖能力,茜素红染色检测矿化结节的形成。生物信息学预测Klf4潜在的下游基因Dmp1,并通过染色体免疫共沉淀(ChIP)、凝胶电泳迁移实验(EMSA)、双荧光素酶报告实验(DLA)检测Klf4对Dmp1的转录调控。在Klf4抑制条件下过表达Dmp1,检测Dmp1与Klf4间的调控关系。 研究结果：Klf4在mDPCs和mDPC6T向成牙本质细胞样细胞分化过程中表达显著上调。过表达Klf4显著上调成牙本质相关基因,如Dmp1、Dspp和Alp,并可促进矿化结节的形成。抑制Klf4表达可下调Dmp1、Dspp和Alp的表达,并抑制矿化结节形成。生物信息学预测Klf4潜在的下游基因Dmp1。通过ChIP、EMSA和DLA的进一步分析,表明Klf4特异性结合于Dmp1启动子区,并转录激活其表达。Dmp1过表达可部分挽救由抑制Klf4表达对成牙本质分化的阻碍作用。 结论：Klf4通过结合于Dmp1启动子上特定区域,转录上调Dmp1表达,从而促进成牙本质细胞分化。 三、间充质中条件性敲除Klf4影响牙本质的矿化 研究目的：Klf4(Kruppel-like factor4)又称为GKlf或Ezf,是Klf4锌指蛋白转录因子家族中的一员,在器官发育、干细胞干性维持和肿瘤发生发展中发挥重要作用。过去的研究发现Klf4特异性表达在极化和延伸期的成牙本质细胞中。在实验二中,通过体外研究探索了Klf4在成牙本质细胞分化中的作用。但是,体内环境下Klf4对成牙本质细胞分化和牙本质形成的调控作用还未可知。本研究试图探索在牙胚间充质中条件性敲除Klf4对成牙本质细胞分化和牙本质形成的影响。 研究方法：将Wnt1-Cre:Klf4f/+小鼠与Klf4f/f小鼠交配就可以得到Wnt1-Cre；Klf4f/f,即在神经嵴来源的细胞中特异的失活Klf4的小鼠。Wnt1-Cre与R26R-LacZ(?)小鼠交配获得Wnt1-cre;R26R-LacZ即神经嵴来源的细胞呈x-gal染色阳性的小鼠。胎龄计算时以查到孕栓的当天中午计为胚胎E0.5天,小鼠出生当天中午计为出生后PN0.5天。按胎龄或出生后日龄获得的小鼠,分离尾鼠织,提取基因组DNA进行基因型鉴定。同一窝小鼠中基因型为Klf4f/+小鼠设为对照组小鼠,将基因型为Wnt1-cre；Klf4f/f小鼠设为实验组小鼠,即条件性敲除小鼠。分离小鼠下颌骨,体式显微镜照相,X-ray检测矿化组织密度,另外一部分组织经过固定,脱水,透明,石蜡包埋,切片用来进行组织学染色分析和免疫组化分析实验。 研究结果：Wnt1-cre;R26R-LacZ经X-gal染色确认Cre重组酶在牙胚间充质细胞中被激活。免疫组织化学检测结果显示,在对照组(Klf4f/+)中,KLF4表达在E18.5与PN0.5的牙尖顶端分化的成牙本质细胞和成釉细胞中,在实验组中(Wnt1-cre;Klf4f/f) KLF4仅表达在PN0.5的牙尖顶端分化的成釉细胞中,成牙本质细胞不表达KLF4。HE染色结果显示在PN1W和PN2W的Klf4条件性敲除小鼠标本中,前期牙本质显著增厚。而Azan染色结果也发现Klf4条件性敲除小鼠的牙本质出现淡染。高分辨X-ray显示Klf4条件性敲除小鼠牙本质灰度显著下降,而牙釉质未发现显著的灰度改变。更有意思的是在PN3M时,2/4的Klf4条件性敲除小鼠出现龋损,并累及所有下颌磨牙,而对照小鼠未见龋损发生。 结论：牙胚间充质中条件性敲除Klf4影响牙本质的矿化。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R780.2

【参考文献】

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1 陈小红,高瑞兰,徐卫红,金锦梅,林筱洁;人参皂甙对红系、粒单系、巨核系细胞株的增殖及转录因子的诱导作用[J];中国中西医结合杂志;2001年01期

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本文编号：2662223