平阳霉素量子点聚乳酸羟基乙酸纳米粒的制备及其对口腔鳞状细胞癌颈淋巴结转移灶的靶向性研究

发布时间：2020-05-15 00:23

【摘要】：口腔鳞状细胞痛(oral squamous cell carcinoma, OSCC)常向颈部淋巴结转移,是导致患者疗效不佳甚至死亡的主要原因之一。随着OSCC的发展,癌组织内大量新生血管形成,渗出增加,因缺乏淋巴管引流而致组织压升高,并向周围组织传导,使癌周组织水肿逐渐加重,癌周毛细淋巴管为适应功能需要而代偿性扩张,并出现大量开放的内皮细胞间通道。加上痛周毛细淋巴管内外压力差,大量的组织液携带着脱落浸润的肿瘤细胞等大分子或颗粒物质,经过这些开放的内皮通道进入毛细淋巴管,从而产生淋巴道转移。口腔颌面部癌瘤一旦发生颈部淋巴结转移,其5年生存率将减少一半,研究OSCC发生颈淋巴结转移后的诊治具有重要现实意义。目前尚无判断OSCC发生颈淋巴结转移的确切方法,对于已经确诊的OSCC,仍然采用以手术治疗为主的多学科综合治疗。由于颌面部所处解剖位置及功能特点,为了彻底切除肿瘤及其转移灶,常会破坏患者的容貌,损坏患者的语言、进食、吞咽等重要功能,影响患者的生存质量。利用OSCC发生后毛细淋巴管特征,将小分子量的抗痛药物与大分子或颗粒物质相结合后行癌周注射,使其通过内皮细胞间通道和内皮细胞的吞噬、胞饮作用进入癌周毛细淋巴管,然后通过淋巴引流到达区域淋巴结转移灶内,可实现对转移痛细胞的靶向化疗。口腔癌原发灶常较表浅,方便在直视下行癌周粘膜或皮下注射,一方面可给药治疗转移癌,具有局部药物浓度高、避免肝脏的“首过效应”、降低全身毒副作用及避免血液中酶对药效的破坏等优点；另一方面可用诊断试剂显示区域淋巴结转移灶,为手术导航。平阳霉素(pingyangmycin, PYM)是中国自行开发和研制的抗肿瘤类抗生素,体外能明显抑制人舌鳞痛细胞系Tca8113细胞生长,在头颈部鳞癌的化疗中使用较多。量子点(quantum dots, QDs)具备独特的光电特征：宽且连续分布的激发光谱,窄且对称分布的发射光谱,光强度较有机染料高10-20倍,能够有效地消除组织或体液对光的吸收和背景干扰,具备抗光漂白性。聚乳酸羟基乙酸(polylactic-co-glycolic acid, PLGA)是经美国食品药品管理局(food and drug administration, FDA)批准可用于人体的生物材料,具备出色的生物相容性、生物降解性和机械强度。本研究选择PYM为模型药物,QDs为荧光探针,PLGA为药物载体,制备集靶向化疗、定位、实时监测多功能于一体的平阳霉素量子点聚乳酸羟基乙酸纳米粒(nanoparticles, NPs)(PYM-QD-PLGA-NPs),并初步探讨其对OSCC颈淋巴结转移灶的靶向性。第一章平阳霉素量子点聚乳酸羟基乙酸纳米粒的制备目的为了靶向治OSCC颈淋巴结转移灶,制备一种集靶向化疗、定位、实时监测为一体的纳米粒。方法 1.以PYM为模型药物、QDs为荧光探针、PLGA为载体,通过正交实验设计,复乳法制备PYM-QD-PLGA-NPs。 2.测量PYM-QD-PLGA-NPs中PYM包封率和载药率。 3.检测(?)PYM-QD-PLGA-NPs的粒径、表面电位。 4.对PYM-QD-PLGA-NPs、PYM、QDs、PLGA进行红外光谱分析。 5.检测(?)PYM-QD-PLGA-NPs的荧光性能。 6.探索PYM-QD-PLGA-NPs体外药物释放规律。结果 1.正交设计实验号4具有相对最高的载药率(drug loading, DL)5.9±0.3%和包封率(embedding ratio, ER)78.1±2.1%。选取该方法制备的PYM-QD-PLGA-NPs进行后续实验。 2.PYM-QD-PLGA-NPs平均粒径为245.4nm,粒径分布指数(partical size dispersibility index,PDI)为0.375±0.009,电位为-6.68±4.11mV。 3.红外光谱图提示PLGA位于PYM-QD-PLGA-NPs最外层,将QDs、PYM包裹在内。 4.在荧光显微镜下,PYM-QD-PLGA-NPs具备QDs相似的红色荧光,反向证明纳米粒包裹有量子点。 5PYM-QD-PLGA-NPs在体外的药物累积释放百分率与Higuchi方程拟合,具有较好的药物控制释放效果。第二章人舌鳞癌Tca8113细胞对平阳霉素量子点聚乳酸羟基乙酸纳米粒的体外敏感性研究目的探讨人舌鳞癌Tca8113细胞对PYM-QD-PLGA-NPs的体外摄取情况及敏感性。方法 1.人舌鳞癌Tca8113细胞增殖曲线 Tca8113细胞以密度1000个/孔、2000个/孔、4000个/孔、6000个/孔、8000个/孔、10000个/孔接种于96孔培养板,每孔190gL培养基,分别于1、2、3、4、5、6、7天后MTS试剂检测细胞增殖情况。 2.细胞摄取实验人舌鳞癌Tca8113细胞按104个/mL、每孔2mL接种于12孔培养板。2天后分别加入QDs和PYM-QD-PLGA-NPs各6孔,每隔1小时至12小时,荧光和自然光通道观察同一视野细胞摄取情况。 3.药物敏感性实验分为PYM、QDs、PLGA、PYM-QD-PLGA-NPs、对照组、调零组共6组,每干预因素组根据PYM浓度设5个浓度组：0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、10μg/mL、分别于加样后1、2、3、4、5、6、7天,MTS试剂检测细胞增殖情况。 4.数据处理和统计分析应用SPSS16.0和Mcrosoft Excel软件进行数据处理和统计分析。药物组间比较应用析因设计资料的方差分析,各实验组间比较采用单向方差分析,两组间多重比较采用Bonferroni法。假设检验为双侧检验,检验水准为a=0.05,P0.05为差异有统计学意义。结果 1.在190μL、10%血清培养基的96孔培养板中,1000个/孔和2000个/孔Tca8113细胞接种密度在第七天仍然保持增殖状态。 2.在相同培养条件及时间下,QDs和PYM-QD-PLGA-NPs均能被人舌鳞癌Tca8113细胞吞饮,PYM-QD-PLGA-NPs被吞饮的量明显较QDs少。 3PYM-QD-PLGA-NPs和PYM抑制Tca8113细胞增殖的能力相似,且均具有浓度、时间依赖性。PLGA对Tca8113细胞增殖无明显抑制作用,QDs对Tca8113细胞增殖有抑制作用但弱于PYM-QD-PLGA-NPs,即PYM-QD-PLGA-NPs对人舌鳞癌Tca8113细胞体外增殖的抑制能力部分来自于PYM。第三章平阳霉素量子点聚乳酸羟基乙酸纳米粒对口腔鳞状细胞癌颈淋巴结转移灶的靶向性评价目的初步评价PYM-QD-PLGA-NPs对OSCC颈淋巴结转移灶的靶向性。方法 1.荷瘤动物模型人舌鳞癌Tca8113细胞107个/mL在裸鼠颊粘膜下每部位注射0.2mL,定期观察肿瘤生长情况。 2.动物活体成像痛周颊粘膜下对称四个部位共注射PYM-QD-PLGA-NPs(药物浓度为100μg/mL)悬液0.2mL。每隔10分钟至2小时,在小动物光学活体成像系统(激发波长488nm,发射波长610nm)下观察NPs体内分布的荧光影像。 3.组织块(器官)及组织切片注射PYM-QD-PLGA-NPs后12小时,处死裸鼠,取痛周组织、同侧颈部淋巴结,制备成组织块(器官)或石蜡组织切片,以自然光和激发光通道同一视野观察NPs分布情况。结果 1.注射后10-15天,裸鼠颊部肿痛直径达0.5cm以上,石蜡组织切片证实已形成颈部淋巴结转灶。 2.裸鼠OSCC痛周粘膜下注射PYM-QD-PLGA-NPs后2小时,小动物光学活体成像系统下同侧颈部淋巴结区域具有癌周注射区相似荧光,提示部分NPs已经自癌周转移到颈部淋巴结。 3.组织块(器官)照片示颈部淋巴结具有癌周组织相似红色荧光,石蜡组织切片示癌周横纹肌边缘和颈部淋巴结髓窦、髓索均见散在的小圆球形红色荧光,进一步证明了PYM-QD-PLGA-NPs已经自痛周转移到颈部淋巴结。全文总结 1.经正交实验设计优化制备的PYM-QD-PLGA-NPs药物ER为78.1%±2.1%,DL为5.9%±0.29%,平均粒径为245.4nm,PDI为0.375±0.009,电位-6.68±4.11mV,具备QDs相似的荧光性能和良好的药物控制释放效果。 2PYM-QD-PLGA-NPs能够被人舌鳞癌Tca8113细胞摄取,但在相同时间段,摄取的量较QDs少。 3PYM-QD-PLGA-NPs和PYM抑制Tca8113细胞增殖的能力相似,且均具有浓度、时间依耐性。PLGA对Tca8113细胞增殖无明显抑制作用,QDs对Tca8113细胞增殖有抑制作用但较PYM-QD-PLGA-NPs弱。 4.PYM-QD-PLGA-NPs经裸鼠颊癌癌周粘膜下注射,小动物活体成像、组织块(器官)荧光照片和石蜡组织切片荧光照片均证实PYM-QD-PLGA-NPs能够靶向于OSCC颈淋巴结转移灶,为后续动物及临床研究提供依据。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R739.8

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