重度慢性牙周炎牙龈组织中TCRβ链CDR3组库的特征分析

发布时间：2020-05-18 12:50

【摘要】：目的:采用高通量测序技术分析重度慢性牙周炎龈下菌斑微生物群落与局部牙龈组织中TCRβ链CDR3组库的特征,探讨重度慢性牙周炎与牙周健康的牙龈组织中TCRβ链CDR3组库的异质性,并初步探索龈下菌斑微生物群落构成对局部牙龈组织中TCRβ链CDR3组库的影响,为进一步研究T细胞在牙周炎发病机制中的作用提供新的研究思路与参考。方法:1.收集牙周健康(H组)及重度慢性牙周炎(P组)病例各5例,术前分别采集1个拟拔牙位点的龈下菌斑,并采集该牙位的牙龈组织,液氮速冻。2.分别提取各牙龈组织样本DNA。3.基因组DNA样本及龈下菌斑样本送华大基因公司进行文库构建并完成测序。4.将所得原始数据经转换整理后,上传至IMGT/High V-Quest系统,分析各样本TCRβ链CDR3组库序列的组成,并采用EXCEL软件、Graph Pad Prism 6软件、Draw Venn Diagram在线软件等分析牙周健康及重度慢性牙周炎牙龈组织TCRβ链CDR3组库中TRBV、TRBJ、V-J配对的基因取用,CDR3组库的多样性、氨基酸长度、氨基酸取用及核苷酸的剪切/插入等。5.初步探索龈下微生物组成的差异对牙龈组织TCRβ链CDR3组库构成的影响。结果:1.H组、P组患者龈下菌斑中微生物基因组测序利用OUT韦恩图分析,结果显示,两组共同定植的核心物种数目较多。而物种多样性的分析显示,P组OUT Rank曲线较H组横轴窄,下降趋势陡,提示P组龈下菌群物种丰富程度及均匀程度较H组低。2.H、P两组龈下菌斑在门水平上的统计分析显示:H组中放线菌门与变形杆菌门显著高于P组(P0.05),而柔膜菌门在P组中显著高于H组(P0.05),且P组中拟杆菌门、螺旋体门、互养菌门均明显高于H组。在属水平上,P组中Bulleidia、丁酸弧菌属、产线菌属、坦纳菌属显著高于H组(P0.05)。种水平上的分析显示,H组中Acinetobacter guillouiae、黄褐二氧化碳嗜纤维菌、罗氏菌、婴儿链球菌显著高于P组(P0.05),P组中牙髓卟啉单胞菌、中间普雷沃菌显著高于H组(P0.05)。3.各牙龈组织样本中TCRβ链CDR3组库的功能性独特序列与功能性总序列的比值分别为:H1:12.15%,H2:12.49%,H3:11.85%,H4:11.39%,H5:11.94%,P1:11.46%,P2:11.39%,P3:8.43%,P4:8.14%,P5:11.57%。H组中独特有效序列的比值较P组高,提示牙周健康组织中具有更为丰富的T细胞克隆。4.各牙龈组织样本中TCRβ链CDR3的多样性分析:各样本的反辛普森指数(1/DS)为:H1:313.12,H2:91.06,H3:167.77,H4:140.44,H5:514.62,P1:304.54,P2:492.33,P3:199.39,P4:79.37,P5:73.97。统计分析显示,H组中1/DS高于P组,但差异无统计学意义(P0.05)。各样本前5条高频克隆增殖序列中未出现完全相同的序列,但发现“YEQY”这个氨基酸基序在两组中均高频出现;而“ETQY”这个氨基酸基序只在P组中发现。P组中独特高度保守的氨基酸基序提示可能与重度慢性牙周炎患者牙周局部环境对特异性抗原所产生的免疫应答有关。5.各牙龈组织样本中TCRβ链CDR3组库TRBV、TRBJ基因家族及V-J配对取用:(1)H组及P组牙龈组织中均高频(2%)取用的TRBV基因有:TRBV10-3、TRBV19、TRBV2、TRBV20-1、TRBV29-1、TRBV5-1、TRBV7-2、TRBV7-9、TRBV9。经统计学分析,P组牙龈组织总T细胞的TCRβ链CDR3组库对TRBV6-8基因的取用频率较H组显著升高(P0.05)。(2)H组及P组均高频(5%)取用的TRBJ基因包括:TRBJ1-2、TRBJ1-5、TRBJ2-1、TRBJ2-7。统计分析显示,与H组比较,P组牙龈组织总T细胞的TCRβ链CDR3组库对TRBJ2-5基因的取用频率显著升高(P0.05)。(3)H、P两组共同的优势配对(1%)基因包括:TRBV19-TRBJ2-7、TRBV2-TRBJ2-7、TRBV20-1-TRBJ1-2、TRBV20-1-TRBJ2-1、TRBV20-1-TRBJ2-7、TRBV5-1-TRBJ2-7、TRBV7-9-TRBJ2-7。经统计分析,与H组相比,P组牙龈组织总T细胞的TCRβ链CDR3组库对TRBV10-3-TRBJ2-5、TRBV11-2-TRBJ2-3、TRBV12-5-TRBJ1-5、TRBV29-1-TRBJ2-5、TRBV30-TRBJ2-1、TRBV5-1-TRBJ2-5、TRBV5-6-TRBJ2-7、TRBV5-8-TRBJ2-1、TRBV6-8-TRBJ1-2、TRBV7-9-TRBJ2-5、TRBV9-TRBJ2-1基因配对取用频率显著升高(P0.05)。其基因的差异性取用可能与牙周局部环境对不同抗原所产生的免疫应答有关。6.各牙龈组织样本中TCRβ链CDR3氨基酸长度和取用分析:H组及P组牙龈组织TCRβ链CDR3氨基酸长度分布,均以12个氨基酸长度为主的正态分布;经统计学分析,两组氨基酸长度分布的差异无统计学意义(P0.05)。H组、P组牙龈组织TCRβ链CDR3区均高频取用丝氨酸(S),两组氨基酸取用无显著差异(P0.05)。氨基酸位点取用分析发现H、P组105位点高频取用丙氨酸(A),106、107位点均高频取用丝氨酸(S),115位点高频取用谷氨酸(E),116位点高频取用谷氨酰胺(Q),117位点高频取用络氨酸(Y);而108、109、110、112、113、114位点的氨基酸取用呈现多样性,从而影响TCRβ链CDR3组库的克隆增殖情况。7.各牙龈组织样本中TCRβ链CDR3组库中独特氨基酸重叠序列:H组5例患者TCRβ链CDR3组库中共同取用的独特氨基酸序列数目为129条,P组5例患者TCRβ链CDR3组库中共同取用的独特氨基酸序列数目为11条;H组及P组10个样本之间共同取用的独特氨基酸序列数目为6条。8.H、P两组TCRβ链CDR3组库中核苷酸的剪切与插入:对两组TCRβ链CDR3区中核苷酸的剪切/插入经统计学分析发现,与H组相比,P组患者牙龈组织中TCRβ链CDR3区中V deletions、N1 insertions、D5 deletions数目显著降低(P0.05)。提示H组TCRβ链CDR3受体库的组成更加丰富,进而可对更多的抗原产生免疫应答。结论:1.H组、P组患者有着不同的龈下菌群构成,P组患者龈下菌群的多样性较H组患者低。两组中具有各自独特的优势菌群,且物种的组成具有显著的差异。2.H组TCRβ链CDR3组库的多样性比P组高,但氨基酸长度及氨基酸的取用差异不显著。部分TRBV、TRBJ基因家族的取用、TRBV-TRBJ配对取用出现显著的差异,且CDR3区核苷酸的剪切/插入数目也存在明显差异。提示H组、P组龈下微生物组成可能影响牙龈组织中TCRβ链CDR3组库的构成,其差异表达的基因可能与牙周微环境中不同抗原所产生的特异性免疫应答有关。
【图文】：

（6）电泳完毕后取出凝胶，置于凝胶成像仪中观察 DNA 条带，并保存凝胶图像。1.2.6 TCR β链 CDR3 组库制备技术根据样品检测结果计算出需取用的DNA样品量，DNA 起始量400ng。将上述样本加入特意设计的 V 区引物和J 区引物使用QIAGEN Multiplex PCR Kit进行多重PCR 反应。将多重 PCR 产物进行电泳，使用QIAquick Gel Extraction Kit 进行胶回收。将纯化回收的 DNA 使用Quibt 荧光仪进行浓度检测，总量大于50ng 即可进行下游常规建库。按照末端修复体系配置相应反应液，进行末端修复反应后使用QIAquick PCR Purification Kit 进行纯化。将上一步末端修复的DNA进行3’端加“A”、加接头反应并使用QIAquick PCR Purification Kit 进行纯化。将上一步纯化好的 DNA 产物使用包含Illumina 测序FlowCell 及index 序列的引物进行PCR 扩增。PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收片段后，使用QIAquick Gel Extraction Kit 进行胶纯化回收，溶于Elution Buffer 中，文库构建完成。建库原理如图1。

按纳入标准选取牙周健康病例 5 例，命名为：H1、H2、H3、H4、H5；重度慢牙周炎病例 5 例，命名为；P1、P2、P3、P4、P5；两组代表性影像资料（图 2A、分别采集各样本的龈下菌斑及牙龈组织（图 2C、D），进行下一步实验。对比两PD、AL、BOP 的改变（表 1），结果差异具有统计学意义（P＜0.05）。A BC D
【学位授予单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R781.42

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本文编号：2669741