氯化锂激活β-catenin信号促进毛囊区神经嵴细胞成牙分化的研究

发布时间：2020-05-18 19:09

【摘要】：[背景与目的]神经嵴细胞(neural crest cells，NCCs)具有多向分化潜能特性，可分化为不同类型的成体细胞和组织。毛囊和牙齿的形态发育均起始于上皮与间充质之间的交互作用。特别对于毛囊而言，这种交互作用一直从胚胎期持续到成年。因此，利用毛囊区神经嵴细胞作为种子细胞应用于牙齿再生引起了广泛的关注。Wnt信号通路在维持干细胞多分化潜能的过程中发挥重要的调控作用。本研究通过氯化锂（Lithium Chloride，LiCl）内源性激活NCCs的Wnt/β-catenin信号通路，探讨其对NCCs增殖活性及成牙分化能力的影响。 [方法]分离培养小鼠触须垫毛囊区NCCs，，利用细胞免疫荧光检测鉴定细胞表型。流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）检测不同浓度LiCl作用不同时间后对NCCs细胞周期的影响，筛选最佳浓度及作用时间；20mM LiCl刺激NCCs24h后，蛋白免疫印迹法（Western blot）和细胞免疫荧光法检测β-catenin在细胞内累积情况,实时定量PCR（Real time PCR）检测干细胞多潜能转录因子Oct-4、klf4、Sox2、Nanog的表达情况。体外分离培养出生后两天小鼠牙胚细胞(Tooth germcells，TGCs)，获取牙胚细胞条件培养基(Tooth germ cell condition culture medium，TGC-CM)。用TGC-CM诱导培养NCCs，相差显微镜下观察细胞形态及排列方式变化。诱导培养7天后，利用细胞免疫荧光和Western blot检测牙本质涎蛋白（dentin sialoprotein，DSP），牙本质基质蛋白1（dentin matrix protein1，DMP1）及Runx2的表达情况。 [结果]1）神经嵴细胞标记物Nestin、p75、Sox10及间充质细胞的标记物Vimentin在从小鼠触须垫区所分离的细胞中阳性表达；上皮细胞标记物keratins8阴性表达。2）20mM LiCl处理NCCs24h后，处于S期的细胞数百分比高于其他各组，细胞周期蛋白CyclinD1和CylinE1表达量明显升高。3）LiCl刺激NCCs后β-catenin在NCCs内的含量升高同时在核内积聚。Real time PCR检测显示LiCl刺激NCCs后Oct-4、klf4、Sox2、Nanog的表达量较对照组表达升高。4）NCCs在TGC-CM诱导下形态伸长,极性排列;呈现较明显的分化状态。5）NCCs在TGC-CM诱导后可检测到成牙本质细胞相关基因DSP、DMP1及Runx2表达，LiCl刺激NCCs后用TGC-CM诱导，DSP、DMP1及Runx2表达明显增强。 [结论]本实验结果证明同通过LiCl的刺激可提高NCCs增殖活性，并一定程度上促进其去分化。NCCs在TGC-CM诱导下牙向分化，并在LiCl作用下成牙分化能力增强，证实激活Wnt/β-catenin信号通路可提高NCCs的成牙分化能力。
【图文】：

图 1 小鼠毛囊区 NCCs 生长特点及形态图 1A 表示组织块贴壁 24h 后细胞形态及分布状况，细胞向外迁移。图 1B 表示传至第三代细胞形态及分布情况，细胞保持梭形状态，呈旋涡状排列。（相差显微镜 40×）2.2 细胞特性鉴定所获取细胞培养至第三代，利用细胞免疫荧光检测神经嵴细胞特异性标记物、间充质干细胞标记物及上皮细胞特异性标记物检测细胞来源及性质。神经嵴细胞特异性标记物巢蛋白Nestin、神经营养因子受体p75和细胞发育相关转录因子Sox10阳性表达，间充质干细胞特异性标记物波形蛋白Vimentin 在细胞中阳性表达，而上皮细胞标记物keratins 8在细胞中阴性表达（图2）。说明本实验成功分离培养细胞为神经嵴来源，可用于接下来的研究。

18图 2 NCCs 表型标记分子检测第三代细胞表现为阳性表达神经嵴特异性标记分子 Nestin、p75、Sox10 及间充质特异性标记分子 Vimentin，上皮细胞特异性标记分子 keratins 8 阴性表达。红色荧光表示标记物，蓝色荧光表示 DAPI 核定位。（正置荧光显微镜 200×,图中标尺表示 100um）
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R783.4

【参考文献】

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1 顾新丰;蒋W

本文编号：2670189