山羊颞下颌关节盘细胞呼吸代谢途径的探索性研究

发布时间：2020-05-20 09:21

【摘要】：背景:颞下颌关节(Temporomandibular Joint,TMJ)是人体最复杂的关节之一,它在口腔颌面部进行咀嚼、吞咽、发音等过程中起重要作用。颞下颌关节紊乱病(Temporomandibular disorders,TMD)是一组与形态和功能相关的肌骨骼系统的退行性疾病。颞下颌关节退行性变与关节盘结构完整性密切有关,其中,以关节盘变薄、透明样变、撕裂和穿孔等不可逆性病变为特征的关节疾患约占整个TMD的5%~10%。近年来,组织工程研究为更换不可逆转损坏的TMJ disc提供了新途径。山羊颞下颌关节盘自组装组织工程技术构建时,在自组装基体培养过程中发现接种一周后的组织小球体积会有明显收缩现象,而自组装基体的收缩不利于关节盘细胞外基质的产生及关节盘基体的生长。同时,对其机制的研究显示,细胞代谢可能参与了其中的病理生理过程。面对这一难题,课题组认为有必要对TMJ disc细胞的生理代谢过程进行研究,对TMJ disc细胞能量代谢途径的研究,可能为阐明上述问题提供帮助和更多依据。目的:初步探索山羊颞下颌关节盘细胞在不同氧糖环境下的代谢途径,了解山羊颞下颌关节盘细胞的生理生化环境与代谢的联系,为TMD的防治研究提供基础数据和参考。方法:体外分离、培养山羊颞下颌关节盘细胞,传代至P2代。P2代细胞于21%O_2完全培养液(A组)、2%O_2完全培养液(B组)、21%O_2无糖培养液(C组)、2%O_2无糖培养液(D组)四种不同环境下培养,其中以21%O_2完全培养液环境培养的细胞作为对照组,各组分别在给予干预条件下第12h、24h、36h、48h、60h检测各项指标。荧光倒置显微镜观察不同条件下关节盘细胞的形态变化;CCK8检测不同环境下关节盘细胞的生长、增殖;Hoechst 33258染色观察不同条件下关节盘细胞的凋亡情况;酶联免疫分析(ELISA)检测关节盘细胞乳酸脱氢酶(LDH)、细胞活性氧(ROS)及超氧化物歧化酶(SOD)含量的变化。通过Mitotracker染色实验观察不同环境下山羊关节盘细胞内的线粒体情况。主要结果:1.荧光倒置显微镜下观察显示:对照组(21%O_2完全培养液)细胞,5个时间点(12h、24h、36h、48h、60h)细胞多为长梭形,糖剥夺后,无论是常氧还是低氧条件,细胞形态与对照组相比,均可见大量细胞由长梭形变为多边形,而单一的低氧条件下,仅见少量细胞由长梭形变为多角形。2.增殖与凋亡结果显示:与对照组相比较,2%O_2完全培养液环境下培养的细胞增殖更好。糖剥夺后,无论是常氧还是低氧条件,细胞的增殖力均显著下降(p0.05),尤其在无糖培养24h,细胞增殖率为负。Hoechst 33258染色显示各糖剥夺组的细胞出现明显的凋亡现象,尤其是在无糖培养24h后,凋亡率持续升高。而2%O_2完全培养液组的细胞与对照组相比,细胞凋亡率下降(p0.05)。这与CCK8实验的结果完全一致。3.细胞内LDH结果显示:对照组(21%O_2)细胞内LDH,自12h开始,持续下降。2%O_2组、糖剥夺组、2%O_2糖剥夺组均出现先上升后持续下降的趋势,24h达到峰值。整体对比发现:只有2%O_2组细胞内LDH各时间点浓度均高于对照组,而糖剥夺后的两组浓度均低于对照组,其中糖剥夺组细胞内LDH浓度最低(p0.05)。4.细胞内ROS结果显示:对照组(21%O_2)细胞内ROS先上升,后下降,36h为峰值。2%O_2组呈先上升后下降,又上升的不断反复趋势。糖剥夺组先下降后上升,36h最低。2%O_2糖剥夺组与对照组一致,呈先上升后下降趋势,36h达到峰值(p0.05)。整体对比,对照组细胞内ROS各时间点浓度均高于其他三组,其中糖剥夺组细胞内ROS浓度最低(p0.05)。5.细胞内SOD结果显示:对照组(21%O_2)细胞内SOD先持续下降,后上升,48h为最小值。2%O_2组呈先下降后上升,又下降的不断反复趋势。糖剥夺组呈持续下降趋势。2%O_2糖剥夺组呈持续上升趋势(p0.05)。整体对比,只有2%O_2组细胞内SOD各时间点浓度高于对照组,而糖剥夺后的两组,细胞内SOD低于对照组(不包括2%O_2糖剥夺组12h),其中,糖剥夺组细胞内SOD浓度最低(p0.05)。另外,各组中的SOD的浓度总是与ROS存在负相关。6.Mitotracker对线粒体染色结果显示:对照组(21%O_2)细胞内线粒体数量自12h时数量开始上升,48h后开始下降。与对照组比较,其余三组(低氧组、糖剥夺组、低氧糖剥夺组)的线粒体数量均少,尤其是糖剥夺后的两组(低氧组、低氧糖剥夺组)线粒体数量显著减少,其中糖剥夺组表现为先上升后下降趋势,24h为峰值。2%O_2糖剥夺组,线粒体数量先增多后减少,36h最多。而低氧组并未观察到明显的线粒体数量变化趋势。整体分析,糖剥夺组线粒体数量最少(p0.05)。这与ROS检测结果基本一致。结论:2%O_2更利于山羊颞下颌关节盘细胞的分解代谢;糖剥夺对山羊颞下颌关节盘细胞的分解代谢有显著下调作用;2%O_2糖剥夺后初期山羊颞下颌关节盘细胞具有适应性反应,但最终其分解代谢能力下降。
【图文】：

修复前口外检查和辅助检查

修复前口外
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R782.6

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本文编号：2672401