兔牙髓前体细胞复合Myroilysin脱细胞异种神经后神经移植物的生物学特性

发布时间：2020-05-20 09:59

【摘要】：背景:周围神经缺损在神经科学中的常见病,其修复是临床治疗的难点。近年来,应用组织工程技术,在体外架构具有良好生物相容性的支架材料用于修复周围神经的损伤已经成为研究热点。将神经修复支架应用于被桥接神经的两断端,可以引导轴突的轴向生长,避免神经瘤的形成,并为神经再生提供相对孤立的微环境。本研究旨在使用Myroilysin酶制备一种新的脱细胞异种神经支架,并在支架上复合具有神经分化潜能的兔牙髓前体细胞,从而获取一种可以促进缺损区域周围神经修复和再生的牙髓前体细胞-脱细胞异种神经复合物神经组织工程复合物。第一部分Myr o i I ys i n 酶法脱细胞异种神经支架的制备与组织结构观察以及机械性能评价目的:应用Myroilysin酶法制作脱细胞异种神经支架,并对支架进行组织结构观察和机械力学评估。方法:获得Wistar大鼠的坐骨神经后,分别用Myroilysin酶和Sondell化学方法对坐骨神经进行脱细胞处理。大体观察脱细胞处理后的神经支架并制作组织切片,光学显微镜下观察HE染色和Masson染色后的支架的脱细胞效果及神经基底膜和胶原结构。通过扫描电子显微镜观察神经支架的表面物理性质。应用Wintest力学测试软件评估支架的一系列机械力学性能指标,如极限载荷、弹性模量、韧度、极限应力、极限应变、断裂功耗等。结果:与Sondell化学处理的神经相比,用Myroilysin酶法处理的神经呈现出显著的膨胀现象。组织学观察可见两种脱细胞神经支架的轴突,细胞,髓鞘结构消失,胶原纤维排列均匀有序,神经基底膜呈波浪状排布。扫描电子显微镜显示,Myroilysin酶法获得的脱细胞神经支架的孔隙和有序排列模式与天然神经更为相似,纵形沟壑状结构更明显。Wintest力学分析表明,Myroilysin酶法脱细胞神经支架的机械力学性能指标与天然神经相比无统计学差异(P0.05)。结论:Myroilysin酶法与sondell化学法脱细胞效果相似,利用Myroilysin酶法制备神经支架对神经支架机械力学影响小,满足支架植入的力学要求,是值得考虑的一种神经支架材料。第二部分兔牙髓前体细胞的体外培养鉴定和神经方向诱导分化目的:体外培养鉴定牙髓前体细胞,并对获得的细胞进行神经方向诱导分化。方法:获取三月龄纯系新西兰大白兔健康牙髓组织以及12-15岁患者中因正畸需要除的健康前磨牙牙髓组织。应用Gronthos酶消化法对牙髓组织进行原代培养,对获得人牙髓前体细胞进行流式细胞术检测鉴定间充质干细胞标记物和神经细胞标记物。对获得的兔牙髓前体细胞进行神经方向诱导并对诱导前后的细胞进行免疫荧光染色,并进行相关间充质干细胞标记物和神经细胞标记物qRT-PCR及 Western blotting 检测。结果:体外培养获得了能够高度增殖的细胞,通过流式细胞术检测人牙髓前体细胞为 CD29+,CD106+,CD44+,CD73+,CD90+/CD34-,CD45-,CD271-,CD133-,CD31-,免疫荧光结果显示培养的兔牙髓前体细胞中存在GFAP,MBP,P75和S-100阳性的细胞。兔牙髓前体细胞神经方向诱导后获得的类神经细胞免疫荧光结果显示 GFAP,MBP,P75,S-100 阳性,qRT-PCR 及 Western blotting结果显示神经表面标记GFAP和MBP表达增加。结论:在本研究中体外培养获得的细胞中存在牙髓前体细胞,将牙髓前体细胞神经方向诱导后可以得到神经表面标记物阳性和分泌神经营养因子的类神经细胞;在牙髓前体细胞中存在功能与神经细胞相似的细胞,可以考虑将GFAP,MBP,P75,S-100阳性的牙髓前体细胞应用于牙髓前体细胞-脱细胞异种神经组织工程神经移植复合物。第三部分Myro i I ys i n酶法脱细胞异种神经支架的体内和体外生物学性能评估目的:评估脱细胞异种神经支架的胶原稳定性和体内外生物相容性,将牙髓前体细胞复合在Myroilysin酶法及Sondell化学法脱细胞异种神经支架,探讨脱细胞异种神经支架的体内和体外生物学性能。方法:应用I型胶原酶酶解天然神经,Myroilysin酶法脱细胞神经支架和Sondell化学法脱细胞神经支架,比较三者的降解情况,从而评估其胶原稳定性。制备支架提取液,并将兔牙髓前体细胞与提取液体外共培养,通过流式细胞增殖与凋亡检测和CCK-8细胞增殖试验评估支架的体外细胞相容性。将兔牙髓前体细胞植入到Myroilysin酶法和Sondell化学法脱细胞异种神经支架中,通过EdU试验观察支架上有无增殖期细胞以及细胞的排列分布。使用与支架浸提液共培养的兔牙髓前体细胞,通过qRT-PCR及Western blotting分析支架浸提液对牙髓前体细胞在mRNA和蛋白水平上表达神经表面标记物及神经营养因子的影响。将复合兔牙髓前体细胞和脱细胞异种神经的神经移植物植入三月龄纯系新西兰大白兔坐骨神经缺损模型内,分别于30天,90天后分析兔坐骨神经缺损模型移植后坐骨神经及其支配骨骼肌恢复情况。结果:Myroilysin酶法和Sondell化学法脱细胞神经支架的降解速率与天然神经基本一致;将兔牙髓前体细胞与脱细胞神经浸提液共培养后,Myroilysin酶法脱细胞异种神经浸提液的细胞增殖活性高于单独培养和Sondell组,表现出良好的细胞相容性,但Sondell组细胞增殖速度明显下降,表现出对细胞明显的毒性;Myroilysin酶法脱细胞异种神经支架可使兔牙髓前体细胞粘附其上并呈现较为明显的方向性生长方式,但在Sondell组支架上并没有发现增殖细胞,并且细胞分布散乱。用Myroilysin酶法脱细胞异种神经支架浸提液培养兔牙髓前体细胞后,细胞的神经表面标记物MBP和S-1 00在mRNA水平和蛋白水平出现上调,betaⅢ Tubulin,CD90,NeuN和神经营养因子BDNF及NGF在mRNA水平出现了上调。将复合兔牙髓前体细胞和脱细胞异种神经的神经移植物植入三月龄纯系新西兰大白兔坐骨神经缺损模型内后,30天后EdU检测见Myroilysin复合牙髓前体细胞组S-100阳性增殖期细胞增加,CD31阳性增殖期细胞深入支架内部,90天后Myroilysin复合牙髓前体细胞组复合动作电位幅度和神经传导速度与自体神经移植对照组差异减小(P0.05),肌湿重恢复率无明显差异(P0.05)。结论:在本研究中Myroilysin酶法脱细胞异种神经支架具有与天然神经类似的体外降解率,体外和动物体内细胞相容性良好,可诱导牙髓前体细胞向神经细胞方向的分化。其多孔纵向沟壑状结构和保存完好的周围神经细胞外基质成分可使牙髓前体细胞粘附生长在支架上。将兔牙髓前体细胞-Myroilysin酶法脱细胞异种神经移植复合物植入三月龄纯系新西兰大白兔坐骨神经缺损模型后,修复效果接近自体神经移植。牙髓前体细胞-Myroilysin酶法脱细胞异种神经神经组织工程复合物可以成为修复周围神经缺损的神经移植物新选择。
【图文】：

神经,放大倍数,酶法,扫描电镜观察

Ａ取材；Ｂ为Ｓｏｎｄｅｌｌ化学法（左为天然神经，右为脱细胞神经）；Ｃ为逡逑Ｍｙｒｏｉｌｙｓｉｒｉ酶法（左为天然神经，右为脱细胞神经）；Ｄ，Ｇ，Ｊ：为天然神经逡逑ＨＥ和Ｍａｓｓｏｎ染色（放大倍数为２００Ｘ），扫描电镜观察（放大倍数为２０Ｘ）；逡逑Ｅ，，Ｈ，Ｋ：为化学法处理的神经ＨＥ和Ｍａｓｓｏｎ染色（放大倍数为２００Ｘ），扫描电逡逑镜观察（放大倍数为２０Ｘ）邋；邋Ｆ，邋Ｉ，Ｌ：为Ｍｙｒｏｉｌｙｓｉｎ酶法处理的神经ＨＥ和逡逑Ｍａｓｓｏｎ染色（放大倍数为２００Ｘ），扫描电镜观察（放大倍数为２０Ｘ）逡逑７３逡逑

神经,方向诱导,基因

图５邋Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ｑＲＴ－ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ．检测兔牙髓前体细胞神经方向诱导前后逡逑神经相关标记基因及蛋白的表达逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R783.6

【相似文献】