重组放线共生放线杆菌LTB-FAP融合蛋白及抗粘附作用的研究

发布时间：2020-05-21 15:40

【摘要】：牙周炎是人类最常见的慢性感染性疾病。局限性侵袭性牙周炎（localized aggressive periodontitis，LAP），发展迅速，具有侵袭性，是牙周损害特别严重的感染性疾病，主要发生在青春期，如果不经治疗，可以很快的造成牙周组织毁坏，局部牙槽骨吸收，牙齿缺失，主要发生在切牙和第一恒磨牙。它是一种细菌感染性疾病，现在主要致病菌已经确定为放线共生放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans,简称A.a)。A.a除可导致牙周炎外，还可引起各种类型脓肿、肺炎、败血症、骨髓炎、尿路感染等疾病，特别应引起注意的是，A.a在引起牙周炎的基础上，可引起传染性亚急性细菌性心内膜炎。牙周炎的治疗目前主要分为机械治疗和药物治疗，效果不十分理想。利用相应抗体治疗牙周炎是目前牙周病治疗研究的一个热点。A.a造成牙周组织损坏的致病机理还不十分清楚，但是它可以产生多种毒力因子，导致牙周组织损害。而粘附是细菌产生毒力作用的首要步骤，菌毛粘附到牙龈组织上是其致病的关键，干扰细菌的粘附可以预防牙周病的发生。因此，针对菌毛的高效价的抗体可以预防牙周病的发生；同时，因为A.a粘附到组织后，还可以脱落下来，所以抗体通过拮抗作用，对牙周炎也起到治疗作用。研究表明，A.a菌毛是由多个菌毛蛋白亚单位fap（fimbrial associated protein也称flp-1）构成的，分子量大约为65KD，其中主要菌毛亚单位是一段起粘附作用的保守性抗原蛋白，其编码基因为228bp，无致病作用，具有较强的诱导抗体产生的能力。有研究者体外化学合成一个fap与其它蛋白的偶联蛋 WP=100 白，并用它免疫动物，获得的抗体有抑制A.a粘附的作用，从而达到预防和治疗牙周病的目的。由于它编码的蛋白分子量小，抗原性较差，所以需要偶连上一段蛋白，增大它的分子量，以增大它的免疫原性。大肠杆菌不耐热毒素（LT）是某些大肠杆菌在生长、繁殖过程中产生并释放出来的一种外毒素，可导致人或幼畜腹泻。它具有很强的诱导粘膜免疫反应的功能，能使机体对与其共同服用的抗原分子产生较强的粘膜免疫反应；LTB诱导的粘膜免疫反应类型为TH1/TH2型，既可以同时诱导机体产生体液免疫反应和细胞免疫反应。国外有研究人员利用Ltb与其它蛋白基因重组，表达出重组蛋白，免疫动物后证明Ltb可以明显的增强机体对其偶连蛋白的体液和粘膜免疫反应。而口腔恰好是粘膜免疫发生作用的重要部位。基于上述认识，我们设计利用fap作为抗原组分，以期利用它刺激机体产生抑制A.a粘附的抗体；利用Ltb增强其免疫反应。并通过Linker与fap连接起来构成融合基因，增加其免疫应答，同时由于LTB可以刺激机体产生针对大肠杆菌不耐热性肠毒素的抗体，所以它也可以作为二价疫苗，对由大肠杆菌不耐热性肠毒素所引起的腹泻起一定的预防作用。本研究有主要以下四方面内容：1从含有LT全毒素基因操纵子的质粒EWD299中扩增出LT的B亚单位基因后，定向克隆于原核表达载体pET28a中，转化大肠杆菌BL21（DE3）plyss，用IPTG诱导表达后，将全菌裂解，用SDS-PAGE和Western-blot检测重组菌中外源蛋白的表达情况。结果表明，在原核细胞中高效表达了LTB蛋白，表达的重组蛋白占菌体蛋白总量的38%。2从含有LT全毒素基因操纵子的质粒EWD299中扩增出LT的B亚单位基因toxB，从放线共生放线杆菌中扩增出菌毛蛋白亚单位蛋白的基因fap，用PCR的方法将二基因通过Linker连接起来，而后定向克隆于原核表达载体pET28a中，转化大肠杆菌BL21（DE3）plyss，用IPTG诱导表达后，将全菌裂解，用SDS-PAGE和Western-blot检测重组菌中外源蛋白的表达情况。结果表明，在原核细胞中表达了融合蛋白LTB-(Gly4Ser)2-FAP，表达的重组蛋白占菌体蛋白总量的15%。3将重组质粒pET/LTB和pET/LTB-FAP分别转化大肠杆菌中进行表达，通过超声裂解获得了以包涵体形式表达的外源蛋白；确定了洗涤和溶解包涵体的最佳尿素浓度；用阴离子交换和凝胶过滤柱层析的方法对重组蛋白LTB-FAP进行了纯 WP=101 化，获得了纯度可达90%的包涵体蛋白。4为了证明A.a310菌毛亚单位基因重组融合蛋白LTB-FAP可以诱导机体产生高效价的抗菌毛抗体，抑制A.a菌的粘附能力。我们利用纯化的LTB-FAP免疫新西兰大白兔，通过间接ELISA技术检测其抗体效价，并用获得的抗LTB-FAP血清进行免疫抑制试验。我们获得了高效价的抗LTB-FAP血清，建立了间接ELISA检测抗体效价的方法，抗LTB-FAP血清可以显著的抑制A.a310对颊粘膜上皮细胞的粘附。A.a310菌毛亚单位基因重组融合蛋白可以有效的诱导机体产生抗体抑制A.a菌的粘附。本研究在国内外首次构建了pETLTB-FAP载体,成功的得到了表达，，并进行了抗A.a粘附的研究，证明LTB-FAP可以刺激机体产生免疫反应抑制A.a菌的粘附。这对下一步研究LTB-FAP刺激机体产生粘膜免疫反应、对牙周病的防治、LAP疫苗的研究具有重要意义。
【图文】：

原核细胞,基因,重组蛋白,印迹

条件的优化分别以 0.2mM、 0.6mM、1.0mM、1. IPTG 诱导的重组菌 4hr 后，行 SDS-PPAGE 检测表图 5，图中显示，重组蛋白存在于包涵体中，其表达原核细胞中表达的 SDS-PAGE 结果yss（pET28a/LTB）；2.BL21（DE3）；3 蛋白分子量标准（97 000, 66000,20 000,14 400）tion of the recombinant proteinrom prokaryocyte on SDS-PAGE,1ss（pET28a/LTB）,2.BL21（DE3）,3 Marker图 4 重组蛋白印迹检测plyss（pET28a/LTB）；plyss（pET-28a）Fig4 Western-blot ofprotein LTB expresseplyss（pET28a/LTB）1（pET28a/LTB） 2. B（pET-28a）

重组蛋白,印迹,原核细胞

【参考文献】