Nell-1促进牙髓干细胞神经向分化的相关研究
发布时间：2020-06-08 13:40
【摘要】：目的:Nell-1(Nel-like molecule-1)在成骨分化和骨再生中起到重要作用。前期研究表明Nell-1可以正向调节成牙本质细胞分化和牙本质的形成。我们研究小组发现,Nell-1可以与神经标记物共表达。本实验的目的是通过体内和体外研究探讨Nell-1蛋白在牙髓细胞神经向分化过程中是否发挥正向调控作用。材料和方法:1.采用免疫荧光双染技术对大鼠牙髓组织切片进行Nell-1与神经标记物P物质(Substance P,SP),巢蛋白(Nestin)的染色,来观察Nell-1在大鼠牙髓组织中的分布及其与牙髓神经的关系。2.建立大鼠牙髓炎模型,将浸有Nell-1蛋白的胶原海绵植入大鼠牙髓腔内,免疫组化染色来观察Nell-1蛋白在炎症环境中对牙髓细胞神经标记物的作用。3.利用组织块酶消化法培养人牙髓细胞。采用单克隆法获得牙髓干细胞。采用流式细胞术来检测干细胞表面标记物。成骨诱导液诱导,茜素红染色来观察牙髓干细胞成骨分化能力。成脂诱导液诱导,油红O染色观察牙髓干细胞成脂分化能力。神经诱导液诱导人牙髓干细胞,采用免疫细胞化学染色观察细胞形态改变及相关神经标记物变化。4.将人牙髓干细胞分别与0、50、75、100、125ng/mL的Nell-1蛋白共培养12h、24h、72h。利用实时定量PCR(qRT-PCR)检测神经相关基因(Nestin、神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、β-LⅡ微管蛋白(β-LⅡtubulin))在mRNA水平上的表达,Western Blot技术检测(Nestin、GFAP)基因在蛋白水平上的表达。初步探索Nell-1蛋白对人牙髓干细胞神经向分化的调控作用并确定Nell-1蛋白的最佳有效浓度。结果:1.免疫荧光染色发现,Nell-1在正常牙髓组织中有大量表达,并且与神经标记物SP,Nestin共表达。2.在大鼠牙髓炎模型中,Nell-1组大鼠牙髓细胞神经标记物SP,NSE,Nestin表达呈强阳性。3.利用组织块酶消化法成功培养出了人牙髓原代细胞。单克隆法获得牙髓干细胞。流式细胞仪检测牙髓干细胞表面标记物,CD90、CD44阳性,CD34、CD45阴性。茜素红染色后在显微镜下观察成骨诱导14天,有明显矿化结节形成,油红O染色后在显微镜下观察成脂诱导21天细胞内有桔红色脂滴。细胞免疫组织化学染色在显微镜下观察成神经诱导后4天细胞形态发生明显改变,呈现长突触多边形形态并且相关神经标记物GFAP、NSE表达强阳性。4.人牙髓干细胞与Nell-1蛋白共培养12h,24h,72h后,Nell-1蛋白浓度在100 ng/mL时神经相关基因Nestin,β-Ⅲ tubulin,GFAP mRNA表达量最高。相关基因GFAP,Nestin蛋白表达量较高。结论:1.Nell-1在大鼠牙髓神经中表达,Nell-1蛋白刺激能够促进大鼠牙髓干细胞表面神经标记物表达量升高。2.组织块酶消化法培养人牙髓细胞高效且状态佳。成骨,成脂,成神经向分化实验证明单克隆培养的牙髓干细胞具有多向分化潜能。流式细胞术证明牙髓干细胞为间充质干细胞。3.Nell-1蛋白在体外与人牙髓干细胞共培养,能够刺激人牙髓干细胞表面神经因子表达量增加。
【图文】：
１．３实验结果逡逑１．３．１邋Ｎｅｌｌ－１在大鼠牙毮神经中的表达以及与神经标记物的关系逡逑采用ＨＥ染色观察大鼠磨牙组织学结构（图１．邋Ａ，Ｆ）。通过免疫荧光染色观察牙逡逑髓组织内Ｎｅｌｌ－１的分布及其与神经标记物的关系。Ｎｅｌｌ－１在牙髓组织中呈阳性表逡逑达（图１．邋Ｃ，Ｈ），神经标记物ＳＰ、Ｎｅｓｔｉｎ在大鼠牙髓神经中有表达（图１．邋Ｄ，Ｉ）。在逡逑大鼠牙髓组织中Ｎｅｌｌ－１与ＳＰ、Ｎｅｓｔｉｎ共表达（图１．邋Ｅ，Ｊ）。细胞核采用ＤＡＩ＞Ｉ染色逡逑（图１．邋Ｂ，Ｇ）。该实验结果表明Ｎｅｌｌ－１在牙髓神经中有表达，可能在牙髓细胞的神逡逑经向分化中发挥一定的作用。逡逑１~枴觥觥觥觥觥觥觥鲥义襄危澹撸撸撸撸咤义希模粒校慑危危牛蹋蹋卞危樱绣危停澹颍纾邋义贤迹贝笫竽パ溃危澹欤欤庇肷窬喙乇昙俏锩庖哂馊旧义献ⅲ捍笫竽パ雷橹衅龋湃旧兔庖哂馊旧＃龋湃旧汕逦允狙浪瑁辣惧义现矢春辖峁梗ㄍ迹玻粒疲保埃埃兀瑁危澹欤欤煸诖笫笱浪枳橹械谋泶铮ㄍ迹玻茫龋保埃埃兀ｅ义希樱小ⅲ危澹螅簦椋畹壬窬曛疚镌诖笫笱浪枳橹斜泶铮ㄍ迹玻澹模慑澹保埃埃兀Ｏ赴擞缅义希模粒校扇旧ㄍ迹玻咤澹拢清澹保埃埃兀＃危澹欤欤庇肷窬昙俏锕脖泶铮ㄍ迹玻澹牛叔澹保埃埃兀＃洌义涎辣局剩唬穑浪琛ｅ义希保冲义
本文编号：2703167
【图文】：
１．３实验结果逡逑１．３．１邋Ｎｅｌｌ－１在大鼠牙毮神经中的表达以及与神经标记物的关系逡逑采用ＨＥ染色观察大鼠磨牙组织学结构（图１．邋Ａ，Ｆ）。通过免疫荧光染色观察牙逡逑髓组织内Ｎｅｌｌ－１的分布及其与神经标记物的关系。Ｎｅｌｌ－１在牙髓组织中呈阳性表逡逑达（图１．邋Ｃ，Ｈ），神经标记物ＳＰ、Ｎｅｓｔｉｎ在大鼠牙髓神经中有表达（图１．邋Ｄ，Ｉ）。在逡逑大鼠牙髓组织中Ｎｅｌｌ－１与ＳＰ、Ｎｅｓｔｉｎ共表达（图１．邋Ｅ，Ｊ）。细胞核采用ＤＡＩ＞Ｉ染色逡逑（图１．邋Ｂ，Ｇ）。该实验结果表明Ｎｅｌｌ－１在牙髓神经中有表达，可能在牙髓细胞的神逡逑经向分化中发挥一定的作用。逡逑１~枴觥觥觥觥觥觥觥鲥义襄危澹撸撸撸撸咤义希模粒校慑危危牛蹋蹋卞危樱绣危停澹颍纾邋义贤迹贝笫竽パ溃危澹欤欤庇肷窬喙乇昙俏锩庖哂馊旧义献ⅲ捍笫竽パ雷橹衅龋湃旧兔庖哂馊旧＃龋湃旧汕逦允狙浪瑁辣惧义现矢春辖峁梗ㄍ迹玻粒疲保埃埃兀瑁危澹欤欤煸诖笫笱浪枳橹械谋泶铮ㄍ迹玻茫龋保埃埃兀ｅ义希樱小ⅲ危澹螅簦椋畹壬窬曛疚镌诖笫笱浪枳橹斜泶铮ㄍ迹玻澹模慑澹保埃埃兀Ｏ赴擞缅义希模粒校扇旧ㄍ迹玻咤澹拢清澹保埃埃兀＃危澹欤欤庇肷窬昙俏锕脖泶铮ㄍ迹玻澹牛叔澹保埃埃兀＃洌义涎辣局剩唬穑浪琛ｅ义希保冲义
本文编号：2703167
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/kouq/2703167.html
最近更新
教材专著
