盐酸千金藤碱对牙髓干细胞增殖和成骨分化能力的影响

发布时间：2020-06-08 14:29

【摘要】：背景感染、外伤、肿瘤、先天畸形等疾病均可以引起骨缺损。近年来,基于干细胞的骨组织工程技术飞速发展,使骨再生成为可能。牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)具有易于取材、来源丰富、无伦理争议的优点,是骨组织工程的重要种子细胞。研究发现,小分子化合物可以提供准确、可修改、经济有效的方式来诱导干细胞分化。盐酸千金藤碱是来源于千金藤属植物,人工合成的小分子化合物,具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒及抑制破骨细胞形成的作用。目前关于盐酸千金藤碱作用于DPSCs的相关文献尚未见报道。目的初步探索盐酸千金藤碱对牙髓干细胞增殖和成骨分化能力的影响。方法1.收集成人第三磨牙,采用组织块贴壁法和改良酶消化法进行原代培养,有限稀释法纯化细胞并扩大培养。HE染色观察DPSCs形态,流式细胞技术检测DPSCs表面标志物,成骨分化鉴定DPSCs定向分化能力。2.检测盐酸千金藤碱对DPSCs增殖的影响:实验组DPSCs添加盐酸千金藤碱药物浓度分别为2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L的培养基,对照组添加不含盐酸千金藤碱的培养基,分别在加药后的第24h、48h和72h采用MTT法检测各组的吸光度。3.碱性磷酸酶试剂盒和Western blot检测盐酸千金藤碱对DPSCs成骨分化的影响。碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶活性,Western blot检测成骨蛋白OCN和Runx2的表达。结果1.体外分离培养的DPSCs生长状态良好。HE染色显示,DPSCs为成纤维细胞样形态,呈长梭形,细胞核大而居中,多数为一个细胞核,偶有两个细胞核。流式细胞仪检测显示:CD44阳性表达,CD45阴性表达。DPSCs成骨诱导21天后,茜素红染色可见明显的橙红色矿化结节;2.盐酸千金藤碱对DPSCs增殖的影响:MTT检测显示,与对照组相比,2.5μmol/L和5μmol/L浓度组可以促进DPSCs增殖,并且呈时间依赖性(P0.05),10μmol/L浓度组对DPSCs有轻微抑制作用,但是差异无统计学意义(P0.05);20μmol/L浓度组有明显的细胞毒性作用(P0.05);3.盐酸千金藤碱对DPSCs成骨分化的影响:与对照组相比,2.5μmol/L和5μmol/L浓度组可以提高DPSCs碱性磷酸酶活性(P0.05),并且上调成骨相关蛋白OCN和Runx2的表达(P0.05),10μmol/L浓度组与对照组相比,差异均无统计学意义(P0.05)。结论1.2.5μmol/L和5μmol/L浓度的盐酸千金藤碱可以提高DPSCs的增殖和成骨分化能力。2.20μmol/L浓度的盐酸千金藤碱对牙髓干细胞有细胞毒性作用。
【图文】：

生长状态良好的 P3 代细胞，，以 3×104个/mL 的密度接种在 6 孔板中，待长满 80%左右，分为对照组与成骨诱导组，各 3 孔，对照组用传代培养基培养，成骨诱导组用成骨诱导液培养，每 3d 换液一次，连续培养 21d，然 10%多聚甲醛固定细胞约 10min，茜素红染色 20min，吸弃染液，PBS 缓冲涤 2-3 次，倒置相差显微镜下观察矿化结节形成情况。3 实验结果3.1 牙髓干细胞培养原代培养第 10-12 天时镜下见有少数细胞从组织块边缘游离(图 1.1A)；培养发现细胞包围组织块呈放射状向周边游离，贴壁生长，细胞多数呈长，即成纤维细胞样形态，也有多角形或纺锤状等形态，其中有上皮混杂.1B)；通过有限稀释法得到单克隆细胞(图 1.1C)；通过传代培养使 DPSCs 在大量扩增(图 1.1D)。

牙髓干细胞生长曲线PSCs 生长曲线为典型的“S”型曲线。DPSCs 在接种的第 1-2 天，，处于停滞期，在第 2 天开始增长加速，很快进入快速生长期，，第 6 天开始进入平台期，细胞增殖速度变慢，说明培养的 DPS好，取对数期细胞进行实验（图 1.2）。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R78

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本文编号：2703220