过氧化氢对人牙髓细胞氧化还原状态的影响

发布时间：2020-06-09 05:21

【摘要】： 目的：牙齿美白技术已经有一百多年的历史,随着审美水平的不断提高,牙齿美白日益受到人们的青睐。虽然漂白剂已经有了较多改进,但是其主要成分始终是高浓度的过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2),通过H202分解、形成大量的超氧化物自由基而发挥漂白作用,近年来,为更快达到漂白效果,漂白剂的浓度有增高趋势,其安全性一直受到人们的关注。如漂白后的牙齿出现不同程度的过敏症状。研究证实,H2O2具有细胞毒性,引起人牙龈成纤维细胞还原型谷胱甘肽减少,对细胞形态学和活性有显著影响。H2O2和过氧化脲能够渗透牙釉质和牙本质并进入髓腔,髓腔内的酶类明显被抑制,但没有造成不可逆性损伤。H2O2能否引起人牙髓细胞氧化还原状态的变化尚未见报告。因此,本研究以体外培养的人牙髓细胞氧为研究对象,以人牙髓细胞内氧化型、还原型谷胱甘肽和氧化型、还原型辅酶Ⅱ的含量为指标,同时检测H2O2对人牙髓细胞活性和形态学的影响,从而可能为评估H2O2的安全性提供新方法,为漂白过程中采用低浓度的漂白剂和采取防护措施提供理论依据。方法： 1、本研究采用组织块酶消化法培养人牙髓细胞；使用免疫细胞化学法对所培养细胞进行鉴定；使用550酶标仪测定其吸光度(A)值；使用苏木素-伊红染色法对人牙髓细胞进行染色并观察其形态学变化。 2、使用高效液相色谱法检测H2O2作用后人牙髓细胞内GSH和SSSG的含量,并进一步得出GSSG/GSH的比值。 3使用分光光度法检测H2O2作用后人牙髓细胞内NADPH和NADP+的含量,并进一步得出NADP+/NADPH的比值。结果： 1、人牙髓细胞的培养及H2O2对人牙髓细胞活性和形态学的影响本实验采用组织块酶消化法成功培养出人牙髓细胞并顺利传代。经免疫细胞化学鉴定,提示细胞为间叶组织来源。将人牙髓细胞种于96孔板,分组处理后加入10 ul CCK-8试剂,550酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(A)值。随着H2O2浓度增高,特别是0.4 mM H2O2组,作用时间延长,人牙髓细胞活性显著下降。将人牙髓细胞种于24孔板,分组处理后进行苏木素-伊红染色(HE染色)。0.1 mM H2O2作用1-2h,光镜下未见细胞形态有明显变化,4h时,光镜下见细胞体积稍变小,细胞之间出现小间隙。0.2-0.4 mM H2O2作用1-4 h,光镜下见细胞体积变小变圆,有的形成囊泡,细胞膜失去完整性,细胞之间失去正常的连接,有的细胞发生溶解,并随浓度和作用时间的延长而愈加明显。特别是0.4mM H2O2组,人牙髓细胞体积萎缩,细胞核与细胞质比例失调,大部分细胞膜裂解,细胞死亡,细胞数量显著减少。 2、H2O2对人牙髓细胞内GSH、GSSG及GSSG/GSH的影响 0.1 mMH2O2组,GSH浓度随作用时间延长而降低,GSSG随作用时间延长而升高，GSSG/GSH随作用时间延长而升高。0.2 mM和0.4 mM H2O2组,GSH和GSSG浓度随作用时间延长而降低,GSSG/GSH随作用时间延长而升高,提示人牙髓细胞的的氧化还原状态向氧化方向偏移,但是0.4 mM H2O2作用时间为4 h时,样本中没有检测到GSH和GSSG。 3、H2O2对人牙髓细胞内NADPH、NADP+及NADP+/NADPH的影响 0.1 mM H2O2组,NADPH浓度随作用时间延长而降低,NADP+随作用时间延长而升高,NADP+/NADPH随作用时间延长而升高。0.2 mM和0.4 mM H2O2组,NADPH和NADP+浓度随作用时间延长而降低,NADP+/NADPH随作用时间延长而升高,提示人牙髓细胞的的氧化还原状态向氧化方向偏移,但是0.4 mM H2O2作用时间为4 h时,样本中没有检测到GSH和GSSG。结论： 1、组织块酶消化法是培养原代人牙髓细胞的理想方法之一,H2O2降低人牙髓细胞的活性并能够改变细胞的形态。 2、随H2O2浓度的增高和作用时间延长,人牙髓细胞的的氧化还原状态向氧化方向偏移。
【图文】：

细胞,传代培养,细胞形态,鉴定人

组织块贴壁2一sd后倒置显微镜下可见到少量单个梭形的贴壁细胞，1周后可见贴壁组织块周围有细胞向外游出，随着培养时间的延长游出的细胞逐渐增多，围绕在组织块周围呈放射状向外生长(图2.1.1)，细胞达到70%一80%融合时可将细胞进行消化、传代。传代后细胞可迅速贴壁且分布较为均匀，细胞多为梭形。传代培养3d细胞形态多为饱满的长梭形或扁平状的成纤维样细胞，折光度好，核仁明显。传代培养sd后细胞形态大多为细长成纤维细胞，呈平行排列生长或旋涡状生长，细胞由单层逐渐变为多层，由松散变为紧密(图2.1.2)，当细胞铺满瓶底时进行细胞传代。图2.1.1原代培养的人牙髓细胞(10Ox)图2.1.2第三代人牙髓细胞(100x)2.2人牙髓细胞组织来源鉴定人牙髓细胞的细胞浆中波形丝蛋白呈阳性表达

传代培养,细胞形态,细胞,胞浆

传代培养3d细胞形态多为饱满的长梭形或扁平状的成纤维样细胞，折光度好，核仁明显。传代培养sd后细胞形态大多为细长成纤维细胞，呈平行排列生长或旋涡状生长，细胞由单层逐渐变为多层，由松散变为紧密(图2.1.2)，当细胞铺满瓶底时进行细胞传代。图2.1.1原代培养的人牙髓细胞(10Ox)图2.1.2第三代人牙髓细胞(100x)2.2人牙髓细胞组织来源鉴定人牙髓细胞的细胞浆中波形丝蛋白呈阳性表达，胞浆呈棕黄色，胞核无着色(图2.2.1)，角蛋白呈阴性表达，胞浆无着色，细胞核呈蓝色(图2.2.2)，提示细胞为间叶组织来源。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R783

【参考文献】