RNAi干扰沉默PTP4A1基因对舌鳞癌细胞TCA8113生物学行为影响的研究

发布时间：2020-06-09 23:28

【摘要】：第一部分PTP4A1基因在舌鳞癌组织中的表达及临床意义 目的：检测肝细胞再生磷酸因子-1（protein tyrosine phosphatase typeIVA, member1, PTP4A1）在舌鳞癌中的表达情况,并分析其表达水平与舌鳞癌临床病理参数的关系。 方法：采用免疫组织化学法（SP法）检测15例正常舌组织、30例舌鳞癌组织石蜡包埋切片中PTP4A1的表达；对15例新鲜舌鳞癌组织进行realtime-PCR，检测PTP4A1mRNA在舌癌组织、癌旁组织、正常舌组织的表达。 结果：PTP4A1在舌鳞癌组织中呈阳性和强阳性表达，多见于细胞质和细胞核内，而在正常舌组织中呈阴性和弱阳性表达；PTP4A1在舌鳞癌的阳性表达率为83%，显著高于其在正常舌组织中的表达率33.3%；PTP4A1在舌癌组织和正常舌组织的表达有显著性差异（P0.05）；而且PTP4A1的表达水平与肿瘤的淋巴转移相关（P0.05），而与病人的性别、年龄、肿瘤的大小、肿瘤的分期分级无明显相关。realtime-PCR实验结果显示舌癌组织及舌癌细胞系TCA8113细胞中的PTP4A1的mRNA表达水平高于其在癌旁和正常舌组织的表达，癌旁组织的表达高于正常舌组织的表达（P0.05）。 结论：PTP4A1基因mRNA水平和蛋白水平表达在舌癌组织中高表达，可能在舌鳞癌的发生发展过程中起着一定作用。 第二部分PTP4A1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定 目的：构建shRNA PTP4A1的慢病毒载体，并检测其在TCA8113舌鳞癌细胞株对PTP4A1的抑制效果，且筛选出稳定感染的细胞株。 方法：设计合成五对针对靶基因（PTP4A1mRNA）的shRNA寡核苷酸序列，分别构建质粒，转染293T细胞，根据其对293T细胞PTP4A1基因的抑制率筛选出最有效的PTP4A1基因的RNAi靶序列，设计并合成siRNA的双链DNA Oligo,与含绿色荧光蛋白(GFP)编码基因的hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin重组慢病毒载体siRNA-PTP4A1，共转染293T细胞，包装产生慢病毒，以GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。用realtime-PCR和western-blot检测重组慢病毒质粒感染TCA8113细胞后对PTP4A1基因的干扰效果。 结果：酶切电泳分析以及DNA测序证实成功构建了PTP4A1基因RNAi慢病毒载体,获得相应的慢病毒，浓缩病毒悬液的滴度7.0E+8TU/ml。和对照组相比RNA干扰组TCA8113细胞PTP4A1基因的mRNA和蛋白水平的抑制率分别为55%和60%以上（P0.05）。并成功筛选出稳定感染的舌鳞癌细胞株。 结论：构建的重组慢病毒siRNA-PTP4A1载体能有效的抑制PTP4A1基因在舌鳞癌细胞TCA8113的表达，且成功的筛选出其稳定表达的细胞株，为下一步的研究打下基础。 第三部分RNA干扰沉默PTP4A1基因的表达对舌鳞癌细胞TCA8113的体内外生物学特性的影响 目的：研究沉默舌鳞癌细胞TCA8113中基因PTP4A1的表达对其体内外生物学行为的影响及其机制的探讨。 方法：分别检测PTP4A1下调前后的舌鳞癌细胞TCA8113生物学特性的变化，MTT法检测细胞增殖；流式细胞分析细胞周期和凋亡；平板克隆形成实验检测克隆形成能力；transwell小室检测细胞侵袭的影响；利用Western-blot检测bcl-2、bax蛋白水平表达的变化，以及realtime-PCR检测MMP2、MMP9在mRNA表达水平的变化；通过裸鼠的移植瘤模型观察舌鳞癌细胞TCA8113下调基因PTP4A1表达后在裸鼠皮下移植瘤的生长情况。 结果：下调PTP4A1的表达后，MTT结果显示KD组细胞增殖能力小于NC、CON组；细胞凋亡率也明显增加，，KD组早期凋亡为（17.48±0.70）%，而NC、CON组的早期细胞凋亡率为（7.34±0.70）%和（4.86±0.25）%(P0.01)；KD组细胞周期阻滞在G1/G0和S期(P0.05)；Western blot结果显示bcl-2蛋白表达降低(P0.01)，bax蛋白表达增高(P0.01)；KD组体外克隆形成数小于NC、CON组(P0.01)；穿过人工基地膜的平均数为（35±6）明显少于CON组（134±8.882）及NC干扰组（123±6.557），差异有统计学意义（p0.01）；沉默PTP4A1基因的表达后细胞的MMP2和MMP9在mRNA水平的表达与NC组比较分别降低为27.4%(P0.05)和35.2%(P0.05)；KD组细胞裸鼠皮下移植瘤的生长速度会变慢，最后所得瘤体的重量和体积均小于CON和NC组。 结论：下调PTP4A1的表达对舌鳞癌细胞TCA8113的体外增殖、凋亡、侵袭有明显抑制作用，细胞周期阻滞在G0/G1和S期，其机制可能和PTP4A1下调后bcl-2、MMP-2、MMP-9表达下降，bax表达增加有关。
【图文】：

A B.1 PTP4A1 在舌鳞癌组织（A）和正常舌组织（B）中的表达情况，400×PTP4A1 expression in human tongue squamous tissue(A) and in normal toealtime-PCR 结果图，PTP4A1 mRNA 的相对表达量情况。lts of realtime-PCR and relative PTP4A1NA expressions in different groups图 2.1 载体图谱Fig 2.1 the vector map1 2 3 4 5 图 2.3 各组 FLAG 融合蛋白的表达量。1：空白2：KD2＃;3：KD1＃;4：KD4＃;5：KD3＃;6：K

图 1.2 realtime-PCR 结果图，PTP4A1 mRNA 的相对表达量情况。Fig1.2 Results of realtime-PCR and relative PTP4A1mRNA expressions in different groups图 2.1 载体图谱Fig 2.1 the vector map1 2 3 4 5 6 7 8图 2.2 PCR 阳性克隆图。1:阴性对照 ddH2O；2:空载体自连对照；3:marker;4-8：PTP4A1-GV288 RNAi 转换子鉴定Fig 2.2 the PCR result of positive clone.1：negativecontrol ddH2O；2：empty vector control；3：marker；4-8:PTP4A1-GV248 RNAi convector1 2 3 4 5 6图 2.3 各组 FLAG 融合蛋白的表达量。1：空白载体组2：KD2＃;3：KD1＃;4：KD4＃;5：KD3＃;6：KD5＃Fig 2.3 FLAG protein expression in differentgroup.1:empty vector groups;2：KD2＃;3：KD1＃;4：KD＃;5：KD3＃;6：KD5＃图 2.4 Chromas 测序结果：测通，ok。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R739.86

【共引文献】

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本文编号：2705418