抑癌基因PTEN真核表达载体的构建及对人舌鳞癌SCC-4细胞增殖的影响

发布时间：2020-06-11 21:46

【摘要】：目的 构建并鉴定人野生型PTEN基因绿色荧光蛋白真核表达载体，脂质体介导转染体外培养的人舌鳞癌SCC-4细胞系，观察外源性PTEN基因稳定表达对人舌鳞癌细胞增殖的影响，并初步探讨其相关机制，为进一步研究PTEN基因与舌鳞癌生物学行为之间的关系奠定基础，同时为舌鳞癌的基因治疗提供实验依据。 方法 1、提取人hela细胞总RNA，反转录合成cDNA链，PCR扩增后定向克隆至pMD18-T载体，酶切鉴定并筛选含有PTEN基因的阳性重组载体。分别双酶切pEGFP-N1空载体及pT-PTEN重组载体，获得的大小片段在DNA聚合酶作用下连接，产物经双酶切及测序法鉴定。 2、重组质粒经脂质体介导转染体外培养的人舌鳞癌SCC-4细胞系，分别于转染24、48、72h在荧光显微镜下观察各组细胞内绿色荧光蛋白的表达。实验分为三组：pEGFP-PTEN重组载体转染组（pEGFP-PTEN-SCC-4），pEGFP-N1空载体转染组（pEGFP-N1-SCC-4）及未转染组（SCC-4）。 3、转染48h后，经G418抗性筛选，获得稳定表达PTEN基因的SCC-4细胞，RT-PCR和Western blotting检测各组细胞PTEN基因mRNA及蛋白表达情况。 4、MTT法检测各组细胞增殖能力并绘制细胞生长曲线，观察PTEN基因在体外抑制肿瘤的效应。 结果 1、双酶切及测序法对重组载体进行鉴定，双酶切结果显示出现大小为1200bp左右的目标条带，测序结果与GeneBank中PTEN序列完全一致，表明pEGFP-PTEN重组载体构建成功。 2、经脂质体介导转染24h后，荧光显微镜下见： pEGFP-PTEN-SCC-4组pEGFP-N1-SCC-4组细胞有绿色荧光表达，荧光强弱不均（基因转入的拷贝数略有差异），SCC-4组未见荧光，表明pEGFP-PTEN-SCC-4组和pEGFP-N1-SCC-4组有绿色荧光蛋白基因导入。分别于转染后24、48、72h观察pEGFP-PTEN-SCC-4和pEGFP-N1-SCC-4两组绿色荧光表达情况，结果显示转染48h表达最明显。 3、经G418抗性筛选可见阳性克隆，扩增培养后RT-PCR结果示：3组细胞在1200bp处均有目标条带出现，pEGFP-PTEN-SCC-4组条带明显增粗变亮，相对OD值为0.95±0.04，与pEGFP-N1-SCC-4组（OD值为0.26±0.02）和SCC-4组（OD值为0.24±0.03）比较，差异有统计学意义（p＜0.01）。Western blotting结果显示：3组细胞在55kD处均有目标条带出现，pEGFP-PTEN-SCC-4组条带明显增粗变亮，相对OD值为1.45±0.14，与pEGFP-N1-SCC-4组（OD值为0.17±0.02）和SCC-4组（OD值为0.15±0.03）比较，差异有统计学意义（p＜0.01）。而pEGFP-N1-SCC-4组和SCC-4组细胞RT-PCR及Western blotting结果比较，差异均无统计学意义（p＞0.05）。 4、生长曲线结果显示：pEGFP-PTEN-SCC-4细胞的生长速度明显慢于pEGFP-N1-SCC-4和SCC-4组细胞，说明外源性PTEN能抑制SCC-4细胞的生长。pEGFP-PTEN-SCC-4组在第1、2天的抑制率与对照组比较无统计学差异（p＞0.05）；从第3天开始抑制率有明显差异（p＜0.01），即与pEGFP-N1-SCC-4和SCC-4组比较，pEGFP-PTEN-SCC-4组细胞生长明显受到抑制。pEGFP-N1-SCC-4和SCC-4组细胞之间抑制率在第1～7天均无统计学差异（p＞0.05）。 结论 1、pEGFP-PTEN重组表达载体构建成功。 2、外源性PTEN基因成功转染体外培养的人舌鳞癌SCC-4细胞。 3、外源性PTEN基因稳定表达可以明显抑制SCC-4细胞的生长。 4、PTEN基因有望成为人舌鳞癌基因治疗的新靶点。
【图文】：

Total 10μl2、pEGFP-PTEN 重组质粒转化具体方法同上，，同时设立感受态细菌为阴性对照，pEGFP-Nl 为阳性对照。3、转化子的筛选和鉴定挑取分离良好的 8 个单菌落分别接种于 5ml LB 液体抗性培养基中扩增培养，产物经双酶切鉴定。测序由武汉英骐生物技术有限公司完成。4、pEGFP-PTEN 重组质粒的大量培养将含有重组质粒的菌液 200μl，加入 200ml 的 LB 液体抗性培养基中，37℃过夜培养，按大量提取质粒试剂盒说明书进行质粒抽提，产物于-20℃保存备用。结果一、重组载体构建所需质粒图谱（图 1-1、1-2）

Total 10μl2、pEGFP-PTEN 重组质粒转化具体方法同上，同时设立感受态细菌为阴性对照，pEGFP-Nl 为阳性对照。3、转化子的筛选和鉴定挑取分离良好的 8 个单菌落分别接种于 5ml LB 液体抗性培养基中扩增培养，产物经双酶切鉴定。测序由武汉英骐生物技术有限公司完成。4、pEGFP-PTEN 重组质粒的大量培养将含有重组质粒的菌液 200μl，加入 200ml 的 LB 液体抗性培养基中，37℃过夜培养，按大量提取质粒试剂盒说明书进行质粒抽提，产物于-20℃保存备用。结果一、重组载体构建所需质粒图谱（图 1-1、1-2）
【学位授予单位】：辽宁医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R739.86

【参考文献】

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1 王莉红;张弘彬;刘婷姣;耿莉;刘丽军;王耀;;H-ras和pERK1/2蛋白在舌鳞癌中的表达及相互关系[J];中国医科大学学报;2006年04期

本文编号：2708507