壳聚糖纳米粒包载TLR4受体抑制剂促进种植体骨结合的实验研究

发布时间：2020-06-12 04:04

【摘要】：目的:通过将搭载TLR4抑制剂的壳聚糖纳米微球包被于3D打印的种植体上并植入比格犬体内,探讨TLR4抑制剂在体内抑制炎症反应、促进种植体骨结合的作用。方法:1.将TLR4抑制剂(TAK242)配制成不同终浓度的药液,滴加到接种MC3T3-E1细胞的96孔板中,用CCK-8法筛选适宜的药物浓度。采用离子交联法制备壳聚糖纳米微球(CSn)及搭载TLR4抑制剂的纳米微球(CSn-anti-TLR4),透射电镜(Transimission Electronic Microscopy,TEM)观察两种微球形态,激光粒度仪,红外光谱仪检测两种微球的性质。用Geomagic studio2012及Rhino6.0建模软件设计钛片(Tis),3D打印直径为3cm,孔径为300μm,孔隙率为60%的Tis,用浓盐酸、浓硫酸、去离子水(2:1:1)配置的混酸酸蚀Tis。将两种纳米微球以浸提法包被于酸蚀后的Tis表面,分组:实验组(Tis-CSn-anti-TLR4),壳聚糖组(Tis-CSn)、空白组(Tis),扫描电镜(Scanning Electron Microscope,SEM)观察3组Tis表面;将MC3T3-E1细胞接种到3组Tis上,CCK-8检测细胞增殖情况,荧光染色观察细胞粘附情况。2.挑选8只1.5岁、健康、雄性比格犬,随机标记为B1-B8,选取右侧下颌第三、第四前磨牙作为目标牙,共16颗牙(32个牙根),拍锥形束CT(CBCT)为原始图像,将CBCT图像导入建模软件,用相同方法根据CBCT设计种植体(Ti),3D打印的种植体与Tis的规格相同。将Ti清洗、消毒、灭菌后包被两种纳米微球,分成3组:TLR4抑制剂组(Ti-CSn-anti-TLR4);壳聚糖组(Ti-CSn);对照组(Ti)。常规消毒、全麻下将3组种植体即刻植入比格犬右侧下颌相应前磨牙处,严密缝合。1个月后用Hounsfield Unit(HU)评价种植体骨结合情况,取种植体周围骨组织提RNA,做RT-PCR分析骨组织中相关细胞因子的表达情况。结果:1.CCK-8结果显示:当TAK242药物终浓度为2μM时最有利于细胞增殖。TEM和激光粒度仪结果均显示包载药物后CSn-anti-TLR4的平均粒径(25-155nm,335.6nm)均较CSn(25-29nm,237.4 nm)增大。CSn的zeta电势平均值为+18.8 mv,CSn-anti-TLR4的zeta电势平均值为+12.4mv。与CSn相比CSn-anti-TLR4在1000cm~(-1)处有个明显的波峰。证明TAK242被壳聚糖包饶。SEM观察3组钛片,未酸蚀的Tis表面有尖锐的突刺;酸蚀后的Tis表面圆钝:Tis-CSn表面包被许多CSn微球,Tis-CSn-anti-TLR4表面有CSn-anti-TLR4微球及TAK242的晶体。荧光显微镜下可见细胞在三组Tis上粘附生长良好,CSn-anti-TLR4细胞增殖最多。2.手术后1个月拍CBCT观察骨结合情况。Ti,Ti-CSn,Ti-CSn-anti-TLR4的HU值依次增大;全麻下取骨组织提取RNA检测骨组织中相关炎症因子及TLRs信号通路分子的表达量。Ti,Ti-CSn,Ti-CSn-anti-TLR4中的MyD88 mRNA、TRIF mRNA、IL-10 mRNA、TNF-αmRNA表达依次降低,抗炎症因子TGF-βmRNA表达依次升高,然而TLR4 mRNA、TLR2 mRNA仅在Ti-CSn-anti-TLR4组中表达升高,差异具统计学意义。结论:1.TLR4抑制剂通过抑制炎症反应促进种植体骨结合。2.CSn可能通过抑制TLRs下游通路抑制炎症反应,但不经过TLR2和TLR4通路。3.TLR4抑制剂可能是一种促进种植体骨结合新的治疗策略。
【图文】：

MC3T3-E1 活性，以上数据用方差分析与 Bonferroni 的 t 检验** P<0.001 vs control.nti-TLR4 的性质检测制备的壳聚糖纳米微球和载药壳聚糖纳米微球溶液具TEM），CSn 和 CSn-anti-TLR4 的直径分别约为 25-29n直径明显大于 CSn，且 TAK242 被壳聚糖所包饶。(图粒径和 zeta 电势的检测nti-TLR4 离心冻干后用红外光谱仪检测，与 CSn 相比明显的波峰，其他波峰两者相似（图 2 H，I）。在

2: CSn 和 CSn-anti- tlr4 的特性。(A)CSn 透射电镜 ×50000。(B)CSn 透射电镜 ×200000。)CSn-anti-TLR4透射电镜×50000。(D)(E)液体状态下CSn和CSn-anti-TLR4的平均直径，(F)(G) CSn CSn-anti-TLR4 的 zeta 电势。 (H)(I)CSn 和 CSn-anti-TLR4 的红外光谱。 3D 打印种植体及钛片的 SEM未酸蚀的 Tis 有金属光泽，颜色较亮（图 3 A），酸蚀后的 Tis 金属光泽消失，颜偏暗（图 3 B）。在 SEM 下观察：未酸蚀的 Tis 表面有较多尖锐的金属刺（图 3 C），，蚀后尖锐的突刺变圆钝，表面变粗糙（图 3 D）。将包被 CSn 和 CSn-anti-TLR4 的 Tis于 SEM 下观察，Tis 表面有大量的 CSn 和 CSn-anti-TLR4（图 3 E，F）。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R783.6

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本文编号：2708979