脂肪干细胞（ASCs）膜片复合PRF膜修复种植体周围骨缺损的相关研究

发布时间：2020-06-13 01:16

【摘要】：背景:随着时代的发展,种植体修复已成为越来越多牙缺失患者的选择方式,然而由于外伤,系统系疾病如糖尿病,重度牙周炎引起牙槽骨吸收、丧失是影响种植体修复的关键因素。当前,临床常用的治疗手段包括自体骨、同种异体骨、异种骨和人工骨移植等方式,但均不是最理想的解决方式。骨组织工程(Bone tissue engineering)通过在体外构建细胞-支架复合材料,用于替代上述骨移植材料,被认为是当前最具潜力的骨再生方式。对于种子细胞,与骨髓间充质干细胞(Bone marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)相比,脂肪源性干细胞(Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells,ASCs)具有多向分化潜能的同时,且来源丰富,取材方便,损伤小,成为备受关注的种子细胞。此外,细胞膜片技术将细胞高度密集培养成膜片的形式,避免传统细胞悬液接种到支架上导致的细胞大量流失,是组织工程中被证实行之有效的方法。此外,通过采集外周血液经高速离心后获得的富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)呈三维网络立体结构,富含丰富的血小板和生长因子,可作为组织工程中生长因子的来源,提高ASCs细胞膜片的成骨能力。目的:本实验研究目的旨在探索PRF膜片对ASCs增殖、分化的影响,为临床骨缺损修复运用PRF提供临床依据;探索ASCs膜片复合PRF膜片双膜复合体在种植体周骨缺损的骨再生修复及骨整合的影响。方法:1.分离培养犬ASCs,并通过成骨、成脂以及成软骨诱导分化来鉴定脂肪干细胞。利用膜片培养液连续诱导培养ASCs构建细胞膜片,HE染色和电镜观察膜片结构。2.抽取来自同一供体的犬静脉血离心制备PRF,并做HE染色、电镜观察鉴定;将PRF作用于ASCs,CCK-8检测PRF对ASCs的增殖影响;ALP染色观察PRF对ASCs成骨分化的影响和RT-PCR检测成骨相关基因的表达情况。并在电镜下观察PRF与ASCs膜片复合的情况。3.体内实验:拔除比格犬双侧下颌第三、第四前磨牙,于种植窝一侧制备种植体周围骨缺损模型(4×4×3mm),种植体植入后,于骨缺损内随机植入以下材料:(A)ASCs膜片/PRF组:ASCs膜片复合PRF膜;(B)ASCs膜片组:仅植入ASCs膜片;(D)PRF组:仅植入PRF膜;(D)空白对照组:无材料植入。于术后4W,8W取材,活体荧光双标检测种植体骨缺损内骨矿化沉积率(MAR),Micro-CT扫描分析骨体积分数(BV/TV),骨小梁数目(Tb.N),骨小梁厚度(Tb.Th),骨小梁间距(Tb.Sp)。生物力学实验检测各实验组的最大推力,评价骨质量。硬组织染色分析种植体骨缺损内骨填充率(BF)和骨结合率(BIC)。4.统计学分析,计量资料以均数±标准差(?x±SD)表示,运用SPSS17.0统计软件对实验数据统计分析,P0.05表示有显著性差异。结果:1.经培养鉴定ASCs具有多向分化潜能,并成功构建出ASCs细胞膜片,HE染色显示ASCs膜片由2-4层细胞构成,电镜观察细胞与细胞间有大量细胞外基质(ECM)。2.比格犬静脉血成功制备出PRF,呈乳白色,凝胶状。HE及电镜观察显示PRF由疏松多孔的胶原纤维组成的三维网络结构,大量的白细胞、血小板网络其间。CCK-8结果显示PRF组OD值从第3天后明显高于对照组(P0.05)。经成骨诱导后,与PRF共培养的ASCs,碱性磷酸酶活性表达增强,成骨基因表达均显著升高(P0.05)。3.种植体周骨缺损模型成功建立。术后结果显示,空白对照组仅有少量新骨生成ASCs膜片/PRF组、ASCs膜片组和PRF组均有新生骨,其中ASCs膜片/PRF组新生骨显著。Micro-CT显示,4周和8周时各组的骨缺损修复率即BV/TV(%)分别为:ASCs膜片/PRF组60.90±4.83%,80.85±3.93%,ASCs膜片组9.22±6.38%,68.43±2.70%,PRF组46.92±6.70%,57.48±1.47%,空白组32.89±2.22%,39.00±9.57%,ASCs膜片/PRF组与其他组相比均有统计学差异。组织形态学分析显示ASCs膜片/PRF组中BF,BIC均明显增加。荧光双标检测种植体骨缺损周围骨矿化沉积率(MAR)和生物力学实验结果显示ASCs膜片/PRF组在8周时明显增加。(P0.05)结论:1.PRF体外可促进ASCs增殖和成骨向分化;2.将ASCs细胞膜片与PRF膜复合运用于种植体周围骨缺损中,可显著促进骨再生修复和种植体周围骨整合。本研究进一步推进了以细胞膜片为基础的组织工程在骨再生中的发展,为组织工程骨进一步研究和临床应用提供了实验依据。
【图文】：

腹股沟,脂肪组织

扫描电镜 Hitachi，日本1.2 实验方法1.2.1 ASCs 体外分离、培养比格犬称重，按 1ml/kg、3%戊巴比妥钠对比格犬进行肌肉注射，全麻后，于比格犬腹股沟处备皮、消毒，切开皮肤及皮下组织，过程中注意止血，切取约 5ml脂肪组织放入含有双抗的 PBS 溶液中，转入超净工作台，PBS 反复冲洗，去除筋膜血管，充分剪碎，加入 0.1%I 型胶原酶，37℃恒温震荡消化 40 分钟。加入等体积 DMEM-F12（含 10%FBS、1%双抗）终止消化，，置入离心机中，1000r/min，离心 5 分钟，弃上层组织，200 目筛网过滤，再次离心后，DMEM-F12 重悬，移至25cm 培养瓶中，5% CO2、37℃细胞浮箱中常规培养，24 小时后可见原代细胞零星分布，每 2-3 天进行细胞换液，待细胞生长达到约 90%时进行细胞传代，显微镜下观察细胞形态并拍照记录。

细胞,细胞生长,形态,脂滴

图 1-2ASCs 细胞生长形态（A：P0 代细胞×40；B：P3 代细胞×100）Figure 1-2 Morphology of ASCs (A：P0×40, B:P3×100).2 ASCs 的多向分化鉴定成骨诱导：ASCs 经成骨诱导后细胞形态呈短梭形，细胞外基质分泌增多，胞颜色加深，开始有钙盐沉积。3 周后经茜素红染色，可见红染的团块状钙化结节。明 ASCs 具有成骨分化的能力。成脂诱导：经过成脂诱导的 ASCs，细胞由长梭逐渐变圆，细胞内可见小脂滴形成，随着诱导时间的延长，脂滴逐渐变大。油 O 染色镜下显示细胞中可见许多大小不一的橘红色脂滴，说明细胞分化成了脂细胞。成软骨诱导：经成软骨诱导 2 周后，阿利新蓝染色镜下观察可见细胞内见蓝色胞浆，说明细胞具有成软骨向分化的能力。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R783.6

【参考文献】