CGF、PRF对人牙髓干细胞增殖、成牙本质分化及相关因子表达的比较研究

发布时间：2020-06-13 08:26

【摘要】：目的:研究不同浓度CGF(Concentrated Growth Factors,浓缩生长因子)、PRF(Plate Rich Fibrin,富血小板纤维蛋白)提取液对h DPSCs(human Dental Pulp Stem Cells,人牙髓干细胞)增殖的影响;获得最佳促增殖浓度,探讨该浓度提取液对牙髓干细胞迁移、成牙本质分化及相关因子表达的影响。方法:(1)组织块结合酶消化法获得牙髓细胞,单克隆法从中获得h DPSCs,采用免疫组化染色检测波形丝蛋白和角蛋白的表达,流式细胞术检测h DPSCs表面特异性标志物,成骨及成脂分化诱导鉴定其细胞干性。(2)反复冻融法制备CGF、PRF凝胶提取液,酶联免疫吸附法检测各提取液中TGF-β1和PDGF-AA的浓度;分别使用对照组:10%FBS组,实验组:10%、20%、30%、40%CGF和PRF提取液组与h DPSCs共培养,CCK-8法检测细胞活性,获得最佳促h DPSCs增殖浓度。(3)细胞划痕实验比较10%FBS、20%CGF、20%PRF对h DPSCs迁移的影响。(4)茜素红染色、ALP染色和ALP活性试剂盒分别检测10%FBS、20%CGF、20%PRF对h DPSCs成骨诱导分化的影响。(5)q RT-PCR检测10%FBS、20%CGF、20%PRF对h DPSCs成牙本质诱导分化过程中相关特异性基因表达的影响。结果:(1)本实验条件下使用酶消化法结合单克隆法从新鲜离体牙中获得具有间充质干细胞特性的h DPSCs;(2)100%CGF、100%PRF提取液中,TGF-β1和PDGF-AA的含量无统计学差异,10%、20%、30%、40%CGF和PRF提取液促进h DPSCs增殖能力不同,20%CGF组和20%PRF组促进h DPSCs增殖能力最强(P0.05),20%CGF组促进h DPSCs增殖能力比20%PRF组强(P0.05);(3)与对照组相比,20%CGF和20%PRF均抑制h DPSCs迁移能力(P0.05),20%PRF组抑制h DPSCs迁移能力最强(P0.05);(4)茜素红染色和ALP染色结果显示在促进h DPSCs成骨分化能力由强到弱依次为20%PRF组、20%CGF组、10%FBS组,ALP活性检测显示20%PRF组和20%CGF组促进h DPSCs成骨分化能力相对于对照组强(P0.05),20%PRF组优于20%CGF组(P0.05);(5)q RT-PCR检测结果显示:第3天时,20%CGF组DSPP表达量最高(P0.05);20%PRF组BMP-2和TGF-β1表达量最高(P0.05),各组之间DMP-1表达量无统计学差异;第7天时,20%PRF组高表达TGF-β1和DMP-1(P0.05),各组之间DSPP、BMP-2表达量无统计学差异;第14天时,20%CGF组和20%PRF组DSPP、BMP-2、TGF-β1、DMP-1表达量与对照组相比,具有统计学差异,其中20%CGF组DSPP、BMP-2表达量最高(P0.05),20%PRF组中TGF-β1、DMP-1表达量最高(P0.05)。结论:(1)本实验条件下成功获得具有良好增殖和分化能力的h DPSCs;(2)10%、20%、30%、40%CGF和PRF提取液促进h DPSCs增殖,20%CGF组促h DPSCs增殖能力更强;(3)20%CGF和20%PRF均抑制h DPSCs迁移能力,20%PRF组抑制h DPSCs迁移能力更强;(4)20%CGF和20%PRF均促进h DPSCs成骨分化能力,20%PRF组促进h DPSCs成骨分化能力比20%CGF组强;(5)20%CGF、20%PRF提取液均能促进h DPSCs成牙本质分化,20%CGF组促进DSPP、BMP-2基因表达;20%PRF组促进TGF-β1、DMP-1基因表达。
【图文】：

置显微镜观察矿化结节并拍照。2.6.2 成脂分化诱导取第四代细胞制备单细胞悬液，以每孔 1×104个细胞接种至 6 孔板，随机分为实验组和对照组，每组设置 3 副孔。细胞增殖至 80%汇合态时，实验组改为成脂诱导液（含主要成份为 1 μmol/L地塞米松、10 μmol/L胰岛素、200 μmol/L 吲哚美辛、0.5 mmol/L IBMX、10%FBS、1%双抗的 α-MEM 培养基），对照组只加10%FBS和 1%双抗的 α-MEM培养基，每孔各加培养液 2.5 mL，每 2天换一次液，4 周后弃培养液，PBS 洗 3 遍；4％多聚甲醛室温固定 20 min；PBS 洗 3 遍；0.21%油红“O”染色，，倒置显微镜下观察脂肪粒并拍照。3 结果3.1 牙髓细胞A B

细胞爬片免疫组化结果：抗角蛋白（Cytokeratin）阴性（图 1.3 A），排源于上皮；抗波形丝蛋白（Vimentin）阳性（图 1.3 B），证明细胞来源。B： 抗 Vimentin 阳性，×200A：抗 Cytokeratin 阴性，×200图 1.3 牙髓干细胞细胞爬片免疫组化A B
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R78

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 张晓;董福生;任贵云;董玉英;栗兴超;李建英;冯晓伟;王国光;;富自体CGF纤维蛋白膜对人牙龈成纤维细胞黏附及增殖的影响[J];现代口腔医学杂志;2014年04期

2 杨盼盼;战园;李盛林;刘鹤;;富血小板纤维蛋白对犬牙髓细胞的体外作用[J];北京大学学报(医学版);2013年05期

3 Farbod Rastegar;Deana Shenaq;Eric R Wagner;Stephanie H Kim;Russell R Reid;Hue H Luu;Rex C Haydon;;Mesenchymal stem cells: Molecular characteristics and clinical applications[J];World Journal of Stem Cells;2010年04期

4 李洪涛;段建民;张宏斌;片山直;;液氮冻融洗涤血小板对人牙髓细胞增殖的影响[J];牙体牙髓牙周病学杂志;2010年06期

5 程敏;程琳;冯志远;李广义;;骨形态发生蛋白-2在牙发育各阶段中的表达[J];国际口腔医学杂志;2009年06期

6 高峰;王捷熙;韩颖;;富血小板血浆应用于创伤修复的研究进展[J];中国实验血液学杂志;2009年03期

7 聂鑫;金岩;龙洁;吴凌;敬伟;林云锋;田卫东;;体外组织培养模式的构建及转化生长因子促进牙髓细胞向成牙本质细胞诱导分化的研究[J];四川大学学报(医学版);2008年02期

8 段智霞;郑启新;郭晓东;白玉;袁泉;陈顺广;;BMP-2活性多肽体外定向诱导大鼠BMSCs向成骨方向分化的实验研究[J];中国矫形外科杂志;2007年21期

9 贺慧霞,金岩,史俊南,刘源,胡世颉,董蕊,雷娟;bFGF、TGF-β对人牙髓干细胞增殖和分化能力的影响[J];牙体牙髓牙周病学杂志;2004年07期

10 李威,闫福华,卢友光,林敏魁,赵欣;富血小板血浆对牙髓成纤维细胞附着、增殖的影响[J];口腔医学研究;2004年02期

相关硕士学位论文 前4条

1 杜楠;富自体CGF纤维蛋白膜对体外培养人牙髓干细胞生物学特性的影响[D];河北医科大学;2016年

2 高莹;自体浓缩生长因子（CGF）在犬牙周组织缺损再生中的研究[D];山东大学;2015年

3 齐喜娟;富自体浓缩生长因子纤维蛋白凝胶（液体）活性因子及其含量分析[D];河北医科大学;2014年

4 程亚楠;三种离心方法对L-PRF生物学特性的影响[D];中南大学;2013年

本文编号：2710905