变链素的纯化

发布时间：2020-06-15 04:19

【摘要】： 变形链球菌(Mutans streptococci,简称变链菌或MS)所产生的具有抗菌作用的蛋白成分叫变链素(mutacin)。随着耐药菌株的不断出现,迫使人们不断地寻找新的抗生素。变链素具有广谱抑菌,低作用浓度(MIC)和对青霉素等耐药菌株有效的特点,有可能成为新抗生素的来源,因此变链素具有很大的潜在应用前景,对它的进一步研究很有应用意义。近年来对变链素的研究和开发逐渐成为口腔微生物学领域的一个前沿课题,不断有新的变链素被发现。本研究从MS临床分离株中筛选出变链素活性最强的菌株入手,粗提并分离纯化其所产生的变链素,为进一步发现和研究新变链素,进行氨基酸测序,基因克隆等相关研究奠定基础。方法从3～5岁的儿童中随机选取10例高龋儿童(dmft≥8)和10例无龋儿童(dmft=0),采集其口腔中的牙菌斑,经分离、鉴定得到80株变形链球菌临床分离株,分为高龋组和无龋组(各40株)。用平板法检测两组菌株所产生的变链素对口腔链球菌(Streptococcus oralis)标准菌株ATCC 10557的抑制情况,观察两组菌株产生的抑菌环大小,测量并记录数据。从中选取变链素活性最强的一株变形链球菌临床株,采用氯仿抽提法粗提其所产生的变链素,再将粗提物经固相萃取柱洗脱,收集洗脱液并冻干,将检测有活性的物质重溶于0.1%TFA后经反相高效液相色谱(RP-HPLC)两次分离纯化。粗提物经第一次RP-HPLC纯化后,将收集的洗脱液冻干经活性检测后,合并有活性的物质再以相同的洗脱条件进行第二次RP-HPLC纯化,再将洗脱液收集冻干并进行活性检测,检测出的有活性的物质即为纯化的变链素。结果1.高龋组共40株菌株对ATCC 10557产生的最大抑菌环直径为21mm,最小为6mm,平均值为10.4mm。无龋组共40株菌株对指示株ATCC 10557产生的最大抑菌环直径为28mm,最小为0mm,平均值为6.9mm,T检验显示两组差异具有显著性(t值为3.098,P0.05)。 2.从上述菌株中选取的产生变链素活性最强的菌株“1G”(产生的抑菌环平均直径为20mm)。从该菌株的200ml液体培养基粗提出变链素约15ug,经固相萃取柱洗脱,RP-HPLC两次分离纯化,得到纯化的变链素。结论变链素的产生在变链菌临床分离株中具有广泛性(88%MS临床株对指示株都产生抑菌环),且变链素的产生在菌株和个体之间是具有差异性的;变链素分子量小,分离提纯步骤较复杂,本实验组通过氯仿抽提法,固相萃取技术和RP-HPLC纯化技术将变链素粗提并分离纯化,为变链素的氨基酸测序和基因克隆等相关研究奠定基础。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R78
【图文】：

变形链球菌,典型形态,培养基,琼脂

链素活性检测实验菌株口腔链球菌选取国际标准菌株 Streptococcus oralis ATCC 10557。变链素活性检测deferred antagonism 方法引自参考文献[10]。具体操作步骤如下：将上述链菌分离菌株复苏，接种于TPY平板上（含2%琼脂），厌氧箱中37℃孵育Y（含0.75%琼脂）平板上打小孔若干（孔径为3mm），每个MS菌株挑菌落在每个小孔上接种，48h后在小孔的壁上长满一层厚厚的菌落，此0.8%琼脂的TPY加热溶化，待冷却到50～60℃时，向其注入0.5ml浓度为图 1 变形链球菌临床株在 MSB 培养基上的典型形态Fig 1 Distinctive colony morphology of mutans streptococci on MS medium

抑菌环

11图 2 高龋组变链菌临床分离株产生的抑菌环7G1：直径为 8mm； 7G2：直径为 7mm；9G1：直径为 9mm； 9G4：直径为 7mm。nhibition zones of MS isolates from caries-acthibition zone is 8mm; 7G2:Diameter of inhinhibition zone is 10mm; 9G4:Diameter of inhi

【引证文献】