口腔粘膜人工固有层的实验研究与口腔粘膜固有层的临床应用

发布时间：2020-06-17 05:24

【摘要】： 前言组织工程技术是创伤修复领域的新兴技术,使应用少量组织获取大量细胞并用于修复大块组织缺损成为可能,有学者将培养好的口腔粘膜上皮片覆盖修复患者口腔粘膜缺损,避免了供皮区的负损伤。目前,用于修复皮肤缺损的组织工程皮肤有Apligraft,用组织工程真皮修复人皮肤缺损的,仅是美国的Dermagraft。体外研究发现,组织工程口腔粘膜固有层中的口腔粘膜成纤维细胞(oral mucosa fibroblast OMF),比相同条件下人工真皮中的皮肤成纤维细胞有更强的重塑细胞外基质的能力,和更强的减少瘢痕的能力,皮肤成纤维细胞和OMF同源于胚胎时期的中胚层组织,因此,本文用大鼠OMF、鼠尾1型胶原、壳多糖构建组织工程固有层后,同种异体移植修复大鼠口腔颊粘膜全层缺损区,修复大鼠背部皮肤圆形全层缺损区,对手术后受植区的发展变化和愈合过程进行研究。颌面部创口愈合是口腔外科医生遇到的基本问题,而至今未见唇裂术后上唇瘢痕组织形态的报道;皮肤真皮组织已被用于整形手术的皮下充填和隆起外形上,未见将口腔粘膜固有层移植于皮肤创口表皮下方的研究报道。因此本文对患儿唇裂术后瘢痕组织形态进行研究;利用唇裂手术中将扔掉的唇粘膜组织,自体移植于皮肤切口内,观察移植术后的发展变化。材料和方法 1.1材料主要试剂;DMEM,胰蛋白酶,胎牛血清,1.8～1.9mg/ml鼠尾Ⅰ型胶原;大鼠尾由我校提供,壳多糖,两性霉素B。病理取材;标本取自在我口腔外科做过唇裂手术的再住院患者(7例),在患者唇鼻再修整术中,将上唇较宽的线状瘢痕取下,10%中性福尔马林液中固定,石蜡包埋,5μm切片,1例瘢痕的部分取下立即放于2.5%戊二醛固定。7例患儿均无瘢痕隆起和瘢痕疙瘩。移植手术中口腔粘膜固有层来源;选择21例来我科行单侧唇裂修复术患者(伴有腭裂),3月至5月龄,将切下的唇红粘膜去掉上皮和脂肪组织,约0.5×0.4×0.10cm~3大小的粘膜固有层剪碎后,放入无菌生理盐水,备用。 1.1.2主要器械;CO_2培养箱,超净工作台,倒置相差显微镜,低温高速离心机,24孔板,游标卡尺,JEM-1200EX透射电镜。 1.2实验动物与方法 Wistar大鼠,21周至25周龄,体健,由我校实验动物部提供。 1.2.1种子细胞的获取及培养;组织块培养法进行,大鼠颊、腭粘膜成纤维细胞原代培养,培养基为含10%胎牛血清的DMEM液(serum contai-ning medium SCM)。胰酶消化,按1;3比例传代培养。 1.2.2胶原网架组织工程口腔粘膜固有层(Fibroblast—populated col-lagen lattice FPCL)的制作,将第5至9代OMF制成细胞悬液,按文献中的配方,在24孔板中制成,每孔0.4ml,内含细胞3.5×10~4,置37℃,5%CO_2孵箱中,1h后凝固,每孔加入0.3ml SCM,3天换液一次。 1.2.3壳多糖胶原网架组织工程口腔粘膜固有层(Fibroblast—popula-ted chitosan collagen lattice FPCCL)的制作;将第5至9代OMF制成细胞悬液,参照朱氏方法加入细胞悬液,混匀,将该混合液吸入24孔板中,其余操作同上。 1.2.4细胞标记;24孔板中FPCL和FPCCL制成后第3天,以含10μM BrdU的上述SCM培养液培养48h后,换SCM,备移植手术用。 1.2.5颊粘膜缺损动物模型制作和分组;21至25周龄Wistar大鼠21只,分为二组,对照组9只;FPCCL移植组12只。大鼠在常规条件下饲养。以上动物的手术过程;大鼠被麻醉后,按照无菌手术要求,将大鼠口周、口腔内消毒,用自制直径0.8cm圆形无菌刀,在大鼠一侧颊粘膜上做圆形全层粘膜缺损区,深达肌肉,即为此模型,实验组将培养5天的FPCCL膜取出,无菌剪刀修剪,平放于颊粘膜缺损区,覆盖凡士林油纱和干纱布,荷包缝扎固定。对照组;颊粘膜缺损区直接暴露。术后单笼常规饲养,不给予抗感染药物,术后七日拆线。术后大鼠颊部组织取材活检时间安排及取材方法;术后第7、14、21天时取材,大鼠被麻醉后,取下受植区及对照组创面全层新生组织,甲醛固定,石蜡包埋,5μm连续切片,备用。组织染色法;将以上三天的石蜡切片,进行苏木素-伊红染色,将第7、14天的石蜡切片进行SP法免疫组化染色,按照试剂盒说明书操作。 1.2.6全层皮肤缺损动物模型制作和分组;Wistar大鼠41只,分为三组,对照组13只;FPCL移植组14只;FPCCL移植组14只。手术过程;按同样方法,在大鼠背部中央做1个圆形全层皮肤缺损区,即为全层皮肤缺损动物模型。对照组的皮肤缺损区直接敷以无菌油纱;将培养5天的FPCL膜和FPCCL膜取出,无菌剪刀修剪,分别平放于皮肤缺损区,然后覆盖凡士林油纱和干纱布,荷包缝扎,固定。大鼠术后皮肤组织取材活检时间安排及取材方法;术后第4、7、14、21和26天时取材,取下受植区全层新生组织,10%甲醛固定,石蜡包埋,5μm连续切片,备用。组织染色法;将以上五天的石蜡切片,进行苏木素-伊红染色,将以上术后第4、7、14、21天的石蜡切片进行SP法免疫组化染色,按试剂盒说明书操作,DAB显色。 1.2.7将以上唇裂的石蜡切片行H、E染色,Weigert弹力纤维染色,戊二醛固定的标本常规处理,透视电镜观察。 1.2.8手术方法;下三角瓣法,鼻槛区域肌层缝合后,将上述剪碎的固有层组织放入该区域的真皮与皮下层位置,然后缝合该处皮肤。术后随访观察记录。 1.3观察指标; 1.3.1大体观察;在术后第1、4、7、14和21天,观察五组大鼠有无感染发生,创面愈合情况,有无移植物脱落,有无出血。鼻槛区手术切口愈合情况。 1.3.2创面大小测量及统计比较;术后第4、7、14和21天,将三组大鼠的背部创面和术后第4、7、14天,另二组大鼠的口内颊部创面,按照Ste-phens方法,测量每个创面直径,以均数±标准差表示,统计分析。 1.3.3光学显微镜下观察,颊粘膜缺损动物模型组术后第7、14、21天的愈合情况;皮肤缺损动物模型组术后第4、7、14、21和26天的愈合情况。以细胞核呈深棕色着色为BrdU阳性细胞。患者唇裂瘢痕组织结构。 1.3.4电镜下观察,唇裂瘢痕中OMF的情况。结果 2.1大体观察;颊粘膜缺损动物模型组,术后第4天FPCCL组12只大鼠中,9只大鼠颊部荷包在位良好,无明显红肿。术后第七天拆线,受植区创口被浅黄色膜覆盖,周围无红肿。术后14天,FPCCL新生粘膜表面有光泽,颜色与周围粘膜颜色相似。移植术后第21天FPCCL组新生粘膜色泽同周围组织的一致。皮肤缺损动物模型组,术后第1天FPCL组和FPCCL组各有一只大鼠背部荷包被爪抓掉,其余26只大鼠术后均未发生感染。移植第7天,三组创面均被结痂或少许纱布覆盖。移植第14天,FPCL组大鼠创口结痂均脱落,创面完全被新生表皮覆盖。FPCCL组与对照组各一例受植区新生皮中央有少许结痂(第17天脱落),其余受植区情况与FPCL组的一致。移植第21天,三组大鼠背部所有创面的新生皮肤光滑,颜色与正常皮肤色相似,均无体毛。 2.2创面直径测量结果;颊粘膜缺损动物模型组,移植第7天时,FPCCL组的直径与对照组间有显著差异(P＜0.05),第14天时,无显著差异。皮肤缺损动物模型组,移植第7天时,FPCL组与FPCCL组、对照组有非常显著差异(P＜0.01),第14、21天时,无显著差异,FPCCL组直径最大(P＞0.05)。 2.3显微镜下观察;颊粘膜缺损动物模型中,术后第七天,FPCCL组创面不完全被薄层新生上皮细胞覆盖。固有层中新生肉芽组织富含毛细血管、炎性细胞、成纤维细胞。免疫组化染色见阳性成纤维细胞分布于固有层中。植入的凝胶网架颜色、形态与周围组织无法区别。移植术后14天,FPCCL组新生上皮厚,有较大的钉突,固有层中成纤维细胞与炎性细胞仍较密集,毛细血管数量稍较术后第7天时减少。免疫组化染色,可见固有层中的阳性成纤维细胞。对照组新生上皮钉突明显,上皮细胞3至4层。术后第21天,FPCCL组新生上皮厚,钉突粗大。新生固有层中细胞数量减少,有少量毛细血管,可见固有层中BrdU阳性的成纤维细胞。对照组新生黏膜结构与实验组的相似。皮肤缺损动物模型组,移植术后第4天,FPCL组、FPCCL组受植创面最表面坏死组织,与下方肉芽组织分离。肉芽组织中有大量炎性细胞,和较多长梭型成纤维细胞,新生毛细血管。新生组织中细胞非常密集。免疫组化染色显示,阳性成纤维细胞出现在新生肉芽组织中,对照组创面中病理组织结构与实验组类似。术后第7天,以上两实验组受植创面表皮细胞正在生长,呈剑尖状向肉芽组织与坏死组织之间穿行。免疫组化染色显示,阳性成纤维细胞出现在肉芽组织的细胞最密集处。对照组与实验组结构相似。移植第14天,两实验组受植区完全表皮化,有钉突,表皮已分层,基底细胞层完整,最表面有角化物,新生真皮中可见BrdU阳性OMF,对照组创面已完全表皮化,无钉突。移植术后第21天两实验组完全表皮化,可见钉突,真皮中新生胶原纤维细小,含较多毛细血管。BrdU阳性成纤维细胞在真皮中仍能看到。对照组完全表皮化,钉突极少,基底细胞层完整,其浅面有1～2层细胞,最表面是角化层,新生瘢痕组织与正常皮肤相比仍有较多的毛细血管,真皮层中的细胞间质纤维仍没有正常真皮的粗大。术后26天,两实验组在H E染色下的新生组织结构与术后第21天的非常相似。 2.4对患者的研究;光学显微镜下,唇裂皮肤切口瘢痕组织表皮层细胞分层清晰;基底细胞层、棘细胞层、颗粒细胞层和角化层,偶见微小的表皮钉突,使基底膜时常与皮肤表面平行。而上唇粘膜瘢痕中上皮细胞分层清晰,从深层至浅层依次为;基底细胞层、中间层和表层,上皮钉突长而大。皮肤瘢痕的真皮层中,胶原纤维呈粗大的束状,伴纤细的弹力纤维,缺少小动、静脉和皮肤附属器。成纤维细胞数量少,核的形态为长梭形。上唇口腔粘膜瘢痕固有层中,易见毛细血管,形成的固有层乳头区富含血管,数量比瘢痕真皮乳头区的血管数量多。固有层中胶原纤维束细,弹力纤维极少,成纤维细胞数量少,呈长梭形。电镜下,粘膜瘢痕中成纤维细胞,细胞浆不丰满,缺少发达的粗面内质网;皮肤瘢痕中,2个成纤维细胞,胞浆不丰满,形态细长。 2.5 21例唇裂手术后患儿,术后7天观察中,鼻槛区域即唇组织自体移植区的皮肤和手术切口,无明显红肿,皮肤创口甲级愈合。15例术后一年半后随访,1例术后4年随访,见移植粘膜固有层的鼻槛处手术瘢痕平坦,质地、颜色与周围皮肤一致;2例未到腭裂手术时间;3例未再到我科做腭裂手术。结论 1.OMF做为修复重建颊粘膜全层缺损、皮肤缺损的新种子细胞是可行和有效的。 2.胶原凝胶、壳多糖-胶原凝胶组织相容性良好,起粘膜固有层、皮肤真皮的细胞外基质作用。壳多糖-胶原凝胶在动物体内限制受植区收缩变小方面优于单纯胶原凝胶。 3.FPCL和FPCCL两种组织工程口腔粘膜固有层做为颊粘膜缺损、皮肤缺损区永久性替代物是可行和有效的。FPCL和FPCCL两组新生皮肤的质量高于对照组的。 4.患儿唇粘膜手术切口瘢痕不同于唇皮肤切口瘢痕的特点;前者形成的钉突长而大,固有层乳头狭长,几乎达新生上皮表面,乳头中富含毛细血管,胶原纤维束较细,弹力纤维极少。 5.患儿唇粘膜固有层自体移植于上唇皮肤切口内无排斥反应,是可行的;自体移植的固有层组织对皮肤创口的愈合具有促进作用。提供了临床参考。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R782
【图文】：

相差显微镜,颊粘膜,大鼠

每3天换液一次。1.2.3细胞标记:24孔板中FPCCL制成后第3天，以含10林MB记U的SCM培养液培养48h后，换常规培养液，备移植手术用(图2)。1.2.4动物的分组:21至25周龄Wistal大鼠21只，分为二组，对照组9只;壳多糖一胶原网架组织工程固有层移植组(FPCCL)12只。大鼠在常规条件下饲养，自由饮用自来水，摄食，每3日换垫料。_ 1.2.5动物的手术过程:大鼠被10%水合氯醛腹腔麻醉后，按照无菌手术要求，将大鼠口周、口腔内消毒，用自制直径0.scm圆形无菌刀在大鼠一侧颊粘膜上做圆形全层粘膜缺损区，深达肌肉，即为颊粘膜缺损区动物模型，实验组将培养5天的FPCCL膜取出，无菌剪刀修剪，平放于颊粘膜缺损区

相差显微镜

一95%铺满后的OMF(倒置相差显微镜x400)

【参考文献】