动态压力作用下体外海藻酸盐微囊化培养兔关节软骨细胞差异蛋白质组学研究

发布时间：2020-06-17 13:33

【摘要】： 应力作用下软骨细胞代谢和功能的改变是导致软骨组织不断生长改建的主要原因。在正常人体关节软骨所受到的各种力中,压力是最主要的,研究表明,软骨受到动态和静态压缩载荷影响了软骨移植物的生物合成。但到目前为止,有关动态压力作用下调控软骨细胞生物学行为变化的分子机制尚不清楚,通过差异蛋白质组学研究可以识别参与细胞生命活动过程中的重要蛋白质,为深入探索其机制提供信息。本研究力图构建类似于体内软骨组织的体外软骨细胞立体培养动态压力加载模型,并借助于蛋白质组学技术,寻找和发现动态压力作用下调控软骨细胞代谢和功能改变的特定的蛋白质分子,为动态压力作用下软骨改建机理的更深入研究提供依据。研究方法:1)取4W龄乳兔膝关节软骨组织,体外分离、培养软骨细胞、对培养的软骨细胞进行蕃红“O”、甲苯胺蓝及II型胶原免疫组化染色等表型鉴定;2)将鉴定具有正常表型的P1代软骨细胞和海藻酸盐复合,形成凝胶小球培养,观察藻酸钙凝胶内软骨细胞生长情况。通过MTT检测确定细胞活性,使用二甲基亚甲兰法测定样品硫酸化糖胺多糖(GAG)的含量,同时对在藻酸钙凝胶内的软骨细胞进行组织学及组织化学染色以鉴定其表型;3)选取浓度分别为1%、2%、3%海藻酸盐,并通过INSTRON3365测定三种浓度海藻酸盐形成凝胶的机械刚度,将P1代软骨细胞分别与这三种浓度的海藻酸钙复合,培养28天,通过MTT法,二甲基亚甲兰法及RT-PCR测定并比较三种条件下软骨细胞增殖状况,GAG含量变化及II型胶原,聚集蛋白聚糖,I型胶原的基因表达状况从而筛选出最有利于软骨细胞生长的3D海藻酸盐凝胶培养环境;4)仿照Shram系统构建了体外立体培养的软骨细胞动态压力加载模型;并参照Shram等压力加载条件给予0.2MPa,0.66Hz静水压持续作用4h,提取培养相同时间的加压组和未加压组藻酸钙凝胶中的软骨细胞总蛋白,进行双向电泳分离,电泳后的凝胶银染,用分析软件对图谱进行分析,从而建立动态压力作用下藻酸盐立体培养条件下兔关节软骨细胞差异表达蛋白质图谱;5)使用基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对得到的肽段进行分析,并结合蛋白质序列数据库,鉴定出差异表达的蛋白点。结果:采用消化法进行幼兔膝关节软骨细胞原代培养,经甲苯胺兰,II型胶原染色鉴定阳性,所培养细胞生长状态良好其软骨细胞表形能够保持3代稳定,且反映其生长增殖能力的生长曲线正常,在体外培养时可经历与在体状况相似的成熟过程,并具有与在体的关节软骨相似的生物学活性。2)在海藻酸钙小球内培养的软骨细胞能够保持球形状态,且随时间的延长,细胞逐渐增殖,GAG含量增多。经蕃红“O”、甲苯胺蓝及II型胶原免疫组化染色均为阳性。鉴定证实为具有正常表型的软骨细胞。3)浓度对海藻酸钙凝胶的机械刚度具有显著的影响。1%的海藻酸钙凝胶的压缩模量为19.44±2.72显著低于2%(167.09±12.43)和3%(226.24±19.82)。在培养的21天,软骨细胞在较软凝胶内增殖较快,但在21天后,在最软的凝胶内细胞增殖显著减少;基质积累随海藻酸盐刚度改变而不同。在培养第四周,软骨细胞在中间刚度组表现出最高的GAG合成,而软骨特征性基因CoLII、Agg的表达在具有中等刚度的凝胶内最稳定;4)通过双向电泳技术我们建立了动态压力作用下立体培养的软骨细胞差异表达蛋白质图谱。未加压组检测到1632±54个蛋白点,加压组检测到1698±13个蛋白点。通过软件分析,找到了10个差异蛋白点,其中2个在加压培养后表达消失;2个在加压培养后出现表达;6个表达增强。5)将这10个蛋白点通过质谱(MALDI-TOF-MS)分析,获得相应的肽质量指纹图谱,进一步通过蛋白质序列数据库鉴定了8个蛋白点,其中有意义的蛋白点6个。它们分别是:prolyl 4-hydroxylase alpha I,pyruvate kinase,L-lactate dehydrogenase A,Prolyl 4-hydroxylase subunit beta,destrin isoform,alpha enolase。结论:1)采用酶消化法获得幼兔关节软骨细胞的方法简便可行。体外培养的原代或P1,P2代软骨细胞具有良好的软骨细胞表型特征,适用于实验研究。2)软骨细胞在藻酸钙凝胶小球中生长维持了球状形态,细胞少量增殖并合成GAG,II型胶原,说明海藻酸钙凝胶适合于软骨细胞的生长。3)具有中等刚度的海藻酸钙凝胶更有利于软骨细胞的生长和软骨表型的维持。4)利用差异蛋白质组学方法研究动态压力作用对立体培养的软骨细胞的影响是可行的;5)通过差异蛋白质组学研究我们发现了动态压力作用下调控软骨细胞生物学行为的6个有意义的关键蛋白质,并推测了其在软骨改建中的作用。为今后研究这些差异蛋白在软骨细胞受压力刺激后代谢和功能变化的生物学作用奠定了基础。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R78;R684
【图文】：

基质,软骨细胞,凝胶,软骨组织

图 1 海藻酸钙凝胶的“蛋格”结构海藻酸钙水凝胶具有高孔隙率，平均孔隙直径在 5-200 nm，允许小分子如葡萄糖和氧扩散.其孔径和降解率可通过调节溶液的浓度和类型及交联浓度来改变[35,36].凝胶为微囊化细胞提供暂时性基质支持并允许细胞以较慢的迁移速度通过粘稠的凝胶并黏附到支架的孔隙壁上为营养和废物交换提供半扩散环境.在 Na+富裕的环境中，凝胶的 Ca2+被代替，凝胶结构随时间瓦解[37,38]，从而开放更多的扩散通道使软骨细胞扩增并形成细胞外基质。藻酸盐水凝胶在软骨细胞培养中的应用软骨细胞是软骨组织的细胞成分，他们分泌软骨组织特有的基质，这些基质主要包括 II、IX、XI[39]和 X[40]型胶原，以及聚糖蛋白[41]。但是当软骨细胞单层培养，容易去分化表现出成纤维细胞的表型，分泌 I、III 和 V型胶原，II 型胶原和蛋白聚糖分泌减少[42]。海藻酸盐凝胶具有亲水的本质

铺路石,软骨细胞,立体感,多角形

易受外界因素影响而发生改变。随着时间延长，贴壁细胞逐渐增多，细胞密度逐渐增大，细胞主要为多角形或鹅卵石样，细胞折光性好，立体感强，呈不规则立体“铺路石”样（图1-1A）。以同样密度接种的传代细胞贴壁时间短,约10h左右.贴壁后细胞生长旺盛,一般3-5天即可长满皿底. 原代、P1代、P2代细胞生长良好，增殖，分化及分泌基质的能力强。但到P3代以后，软骨细胞形态逐渐发生改变，细胞伸长变大，呈长梭形，类似于

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