牙龈卟啉单胞菌Hgp44基因诱导人脐静脉内皮细胞分泌IL-6，IL-8的研究

发布时间：2020-06-18 02:13

【摘要】：[目的] 克隆表达牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, P.g)牙龈素中粘附素区域的Hgp44基因,并纯化目的蛋白。观察Hgp44基因作用于人脐静脉内皮细胞后对其产生IL-6,IL-8的影响。 [方法] 通过PCR和基因重组技术,克隆得到P.g ATCC33277的Hgp44基因,插入到克隆载体pMD18-T中并测序鉴定。经过酶切后将目的基因片段与表达载体pET22b相连,构建出表达质粒pET22b-Hgp44。将重组质粒转化到感受态细胞BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达融合蛋白,通过SDS-PAGE, Western blot进行分析。用固定化金属亲和层析法(IMAC)对重组蛋白进行分离纯化,从而获得目的蛋白Hgp44。 培养人脐静脉内皮细胞,用不同浓度的Hgp44蛋白分别作用于HUVECs,用ELISA试剂盒检测IL-6, IL-8的表达变化。 [结果] 成功培养牙龈卟啉单胞菌ATCC33277菌株,并克隆得到目的基因片段,约为1100bp,与预期大小相符,测序结果与GenBank中ATCC33277国际标准菌株的RgpA的等位基因序列U15282一致。IPTG诱导后的菌体经SDS-PAGE后形成一个以包涵体形式存在的44KD的融合蛋白。Western blot检测证实其具有免疫原性。用Ni-NTA柱纯化后复性得到了目的蛋白Hgp44。最后得到终浓度约3.5mg/L的目的蛋白Hgp44。 ELISA检测分析得到,Hgp44能促进HUVECs分泌IL-6和IL-8,从而引起初始的炎症反应。 [结论] 成功克隆表达了牙龈卟啉单胞菌Hgp44基因,并纯化出了目的蛋白。明确了目的蛋白对人脐静脉内皮细胞产生IL-6, IL-8的影响,为进一步阐明Hgp44和人内皮细胞的相互作用关系及明确牙龈卟啉单胞菌与心血管疾病之间的关系奠定了基础。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R780.2

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本文编号：2718531