【摘要】：矫治性牙位移动过程中，牙槽骨的应力改建过程主要是以破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成相互协调的结果。其中张应力区中所发生的由成骨细胞介导的骨形成是错位牙矫治性定向移动中安全和稳定的根本保证。人牙周膜干细胞(PDLSCs)是一群来源于人牙周膜组织，具有多项分化潜能的干细胞，被认为是进行牙周组织修复与再生的理想的种子细胞。已有研究认为，PDLSCs是正畸牙移动过程中骨改建过程的关键细胞。力学刺激作用于该细胞，信号传递是通过胞外基质传导至胞浆引起一系列细胞内的生物学变化，从而触发牙槽骨的应力改建，最终实现了牙齿的定向移动。本课题组前期研究发现：体外培养的PDLSCs中具有Hh信号通路的表达，并且该信号通路参与了PDLSCs的应力成骨过程。 Hedgehog信号通路在哺乳动物多器官的正常发育过程中起关键作用，具有调控细胞增殖、分化和凋亡的能力。研究证实，在胚胎发育软骨内成骨的过程中，Hedgehog信号通路通过细胞表面受体与配体PTCH或SMO竞争性结合而激活，从而诱导MSCs向成骨细胞分化。同时研究表明，Hedgehog信号通路在牙胚发育过程中起关键性的作用，介导了牙胚发育早期上皮与间充质之间、上皮与上皮之间的信号转导。近年来研究提示，Hedgehog信号通路促进了PDLSCs的增殖过程。根据已有研究，Hedgehog信号通路的激活会促进MSCs的增殖并调控MSCs的成骨分化，同时适宜的力学刺激更能有效提高MSCs的细胞活性并增强其功能。但是，在PDLSCs应力成骨过程中Hedgehog信号通路的调控机制如何尚未得以证实。Smoothened(SMO)是Hh信号通路中的重要受体蛋白，负责Hh的信号传导和靶基因的转录，从而激活该信号通路。因此，本实验利用慢病毒载体介导的RNA过表达及干扰技术调节PDLSCs中SMO的表达，研究分析SMO在应力作用下对PDLSCs成骨分化的影响。为进一步研究SMO基因的功能及靶向调控PDLSCs应力作用下的成骨分化奠定实验基础，以期待进一步揭示矫治性牙位移动过程中牙槽骨应力条件下的改建机制。 目的： 体外构建及筛选人SMO基因的慢病毒过表达及干扰载体，使用此载体调节PDLSCs中SMO基因的表达并检测其在应力作用下对PDLSCs成骨分化的影响。 方法： 1、人牙周膜干细胞分离、培养及鉴定： PDLSCs来源于临床上12—24岁之间因正畸需要或阻生而拔除的牙体牙周均健康的新鲜牙齿，并经知情同意。用含1%双抗的PBS反复冲洗，冠根单向刮取牙根中1／3的牙周膜，采用酶消化组织块法联合培养，48h后首次换液，后每3d换液，细胞融合至80㳠时传代，经流式细胞分选获得PDLSCs，经镜下观察细胞形态及其克隆形成能力；免疫组化检测其角蛋白及波形蛋白表达；流式细胞术分析其细胞表面标志物STRO-1、CD146；成骨、成脂诱导分化试验等进行干细胞特性鉴定。 2、慢病毒感染： PDLSCs分别被携带SMO特异性过表达、RNAi的慢病毒感染，通过real-time PCR、Western blot检测PDLSCs中SMO基因的表达。实验分四组，包括由携带SMO特异性过表达慢病毒感染的PDLSCs/SMO-过表达组、由携带SMO特异性RNAi慢病毒感染的PDLSCs/SMO-RNAi组、由空慢病毒感染的PDLSCs/vector组和正常细胞对照PDLSCs/wt组。 3、细胞应力加载： .将第4—6代PDLSCs的四组细胞分别种于BioFlex专用加载六孔培养板(硅胶模制孔底)内，通过国际标准化水平的加力装置FX-4000T加载动态张应力，加力方式为最大形变量12%，最小型变量为0的正弦波，频率0.1Hz(5s拉伸5s放松)，加力时间为0h(只在BioFlex板中静置培养)、6h、12h、24h，加力完毕后收集细胞，通过Westernblot检测PDLSCs相关成骨标志物Runx2、ALP的表达变化，以及Hh信号通路相关效应蛋白SMO、GLI1、PTCH1的表达变化。 结果： 1、原代培养的PDLCs增殖快，单个细胞有2-4个突起，长梭形或不规则形；通过流式细胞术细胞抗体STRO-1分选所得PDLSCs阳性率为41.7%，其与PDLCs形态相似，体积略小，成旋涡状或放射状排列，细胞具有克隆形成能力；免疫组化检测显示PDLSCs角蛋白表达阴性，波形蛋白表达阳性，说明所得PDLSCs来源于中胚层；流式细胞术检测显示PDLSCs高表达间充质干细胞标志STRO-1和CD146；经成骨诱导液培养21天后镜下可见矿化结节形成，茜素红染色阳性；成脂诱导液培养21天后可见脂滴形成，油红O染色阳性，说明PDLSCs具有成骨、成脂等多向分化能力。 2、定量PCR检测转染过表达病毒后PDLSCs中SMO基因的转录水平变化，结果显示转染过表达病毒的PDLSCs中SMO基因转录水平增加明显，达未转染细胞的15倍，从而成功在PDLSC细胞中获得了SMO基因的外源性表达 3、western blot检测结果显示慢病毒干扰载体能够在蛋白水平有效的下调目的蛋白SMO的表达，表达量降低80%(干扰组灰度值0.22±0.04vs对照组灰度值1.15±0.13，p0.01)。 4、通过FX-4000T应力加载系统对四组PDLSCs进行同一加载方式、不同时间段的应力加载后检测相关蛋白的表达发现： (1) PDLSCs/wt组加力后，ALP、Runx2的表达水平较未加力时上调，说明应力刺激能促进PDLSCs的成骨分化。 (2) PDLSCs/wt组加力后，Hedgehog家族中的膜受体PTCH1、SMO、核心转录因子GLI1及成骨标志物ALP、Runx2的表达均较未加力时升高，说明Hh信号对力学刺激敏感且参与了PDLSCs的成骨分化。 (3) PDLSC/SMO-RNAi组与PDLSCs/wt组比较，在加力早期(0-6h)PDLSC/SMO-RNAi组细胞ALP、Runx2的表达较PDLSCs/wt组低，但是随着加力时间的延长(6-12h)，PDLSC/SMO-RNAi组细胞ALP、Runx2的表达仍有升高趋势，这一结果提示，SMO基因与PDLSCs应力成骨过程密切相关，同时Hh信号并非是应力促进PDLSCs成骨分化的唯一途径，应力刺激还可以通过其他通路或因子促进PDLSCs的成骨分化。 (4) PDLSCs/wt组、PDLSC/SMO-过表达组、PDLSC/SMO-RNAi组应力加载后，ALP、Runx2的表达量均在12h时升高最明显，说明应力刺激12h时具有较强的促成骨分化作用。 (5) PDLSCs/wt和PDLSC/SMO-过表达组在加力的早期(0-12h)ALP、Runx2的表达量逐渐增加,在加力晚期(12-24h)ALP、Runx2的表达量逐渐降低，这一趋势也提示Hedgehog信号通路对成骨分化的作用：早期表现为促进，而晚期表现为抑制。 (6)在不同的时间段，PDLSC/SMO-过表达组ALP、Runx2的表达均比PDLSCs/wt及PDLSC/SMO-RNAi组细胞显著，说明SMO基因对PDLSCs成骨分化的促进作用明显。 结论： 1、从人牙周膜组织中分离培养并经流式细胞仪分选得到的PDLSCs在体外具有一定的克隆形成能力，且细胞表面分子表达情况与文献报道一致，并在诱导环境下表现出明显的分化潜能，具有成体干细胞特性。 2、PDLSCs被携带SMO特异性过表达及SMO特异性RNAi慢病毒感染后，其SMO基因可呈现稳定的高或低表达。 3、通过对各组细胞进行应力加载试验后检测相关蛋白指标提示：Hh信号对力学刺激敏感且参与了PDLSCs应力作用下的成骨分化；力学刺激12h时具有较强的促成骨分化作用；Hh信号对成骨分化的作用，早期表现为促进而晚期表现为抑制；Hh信号并非是应力促进PDLSCs成骨分化的唯一途径，应力刺激还可以通过其他通路或因子促进PDLSCs的成骨分化。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R783.5
【参考文献】
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2 常慧君;Hedgehog信号通路在人牙周膜干细胞应力成骨过程中调控作用的探索性研究[D];第三军医大学;2012年
本文编号：
2726085
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