依普黄酮对牙周膜干细胞增殖和成骨分化的影响及其机制研究

发布时间：2020-06-26 03:34

【摘要】：人牙周膜干细胞(Human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)是一种位于牙周膜内的具有分化为成骨样细胞、成牙骨质样细胞、脂肪细胞以及成纤维细胞等各种功能细胞的间充质干细胞,被视为牙周组织工程最有潜力的种子细胞。如何促进牙周膜干细胞的增殖和成骨分化已经成为牙周组织再生领域研究的热点,雌激素因其在人体骨骼系统中的重要作用被广泛研究,但副作用限制了其临床应用。依普黄酮(Ipriflavone,IP)是一种已广泛应用于临床的植物性雌激素类药物,属于异黄酮衍生物,可直接作用于骨组织、抑制骨吸收,且同时兼有雌激素和降钙素的治疗作用,由于其机理为体内的生理代谢过程,因此并不具备雌激素所产生的各种副反应,具有良好的应用前景。雌激素受体包括经的雌激素α受体、β受体以及近年来最新发现的G蛋白偶联雌激素受体(G protein-coupled estrogen receptor,GPER),又名 GPR30,是一种7次跨膜G蛋白偶联受体。有研究指出GPR30可与雌激素结合后通过多种非基因途径快速介导包括离子通道、激酶的激活以及各种信号通路激活在内的多种细胞内反应,例如 MAPK/Erk(Mitogen-activated protein kinases/extracellular regulated protein kinases)信号通路、cAMP(Cyclic adenosine monophosphate)信号通路、PI3K/Akt(Phosphatidylinositol 3-kinase/protein Kinase B)信号通路等,而这些被激活的信号通路在骨改建过程中也起着举足轻重的作用。LY294002是PI3K/Akt信号通路的特异性抑制剂,属于槲皮素的吗啉代衍生物,目前已用于多项研究,可为PI3K/Akt信号通路参与各种生物调节反应提供有力的证据。目的:本研究旨在探讨依普黄酮对体外培养条件下的人牙周膜干细胞的增殖和成骨分化的影响,并在筛选其最佳浓度后探索PI3K/Akt信号通路和GPR30在依普黄酮促进人牙周膜干细胞成骨分化过程中的作用。最后通过大鼠正畸牙移动复发模型的建立探讨依普黄酮对正畸牙移动复发过程中骨改建的影响,为依普黄酮在正畸临床的应用可行性提供理论实验基础。方法:(1)体外分离培养hPDLSCs:采用组织块法从12～18岁因正畸治疗需要而拔除的健康前磨牙上分离培养原代hPDLSCs,取3～6代生长状态良好的细胞进行后续实验。(2)细胞活性检测试剂盒(Cell-counting kit-8,CCK-8)和碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性试剂盒检测依普黄酮对牙周膜干细胞增殖和成骨分化的影响并筛选药物最佳浓度。(3)平板克隆形成实验和茜素红染色用于再次验证所筛浓度依普黄酮对hPDLCs增殖和成骨分化的促进作用。(4)Western Blot和RT-PCR检测ALP,Runx2(Runt related transcription factor 2)和GPR30的蛋白水平和mRNA水平的表达。通过Western Blot检查Akt和p-Akt的表达水平观察PI3K/Akt信号通路在此过程中的变化。(5)应用LY294002(PI3K信号通路抑制剂)和靶向GPR30 mRNA的小干扰RNA(siGPR30)用于验证GPR30介导的PI3K/Akt途径在该过程中的功能。。(6)通过建立大鼠正畸牙移动复发模型,探讨依普黄酮应用于促进正畸牙移动复发骨改建过程的可行性。采用苏木精-伊红染色法(Hematoxylin and eosin staining,HE)检测牙根间牙周组织形态学变化,采用免疫组织化学染色法检测骨形态发生蛋白2(Bonemorphogenicprotein,BMP2)对骨重建的影响。(7)统计学分析:本实验数据采用SPSS 22.0统计分析软件进行分析,两组数据之间的比较采用t检验,两组数据不同时间点之间的比较采用配对t检验,多组数据之间的比较则采用单因素方差分析,P0.05视为具有统计学意义。结果:在体外条件下,10-7mol/L依普黄酮显著促进hPDLCs的增殖、ALP活性、集落形成效率和矿物质沉积(P0.05)。ALP,Runx2,GPR30和p-Akt的基因表达均相比于对照组上调(P0.05)。LY294002的应用阻断了IP对ALP和Runx2的促进作用;且siGPR30干扰GPR30表达后,PI3K/Akt信号通路的激活被抑制。此外,HE染色和免疫组化染色结果显示,与对照组相比,IP组牙周组织中具有更多的新骨形成。结论:(1)依普黄酮可以显著促进人牙周膜干细胞的增殖和成骨分化,且体外最佳浓度为10-7mol/L;(2)GPR30介导的PI3K/Akt信号通路在依普黄酮促进牙周膜干细胞成骨分化的过程中起着重要作用;(3)依普黄酮可以显著促进正畸牙移动复发过程中的牙周组织骨改建,降低正畸牙移动的复发速率。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R781.4
【图文】：

荧光显示,免疫荧光,角形,波形蛋白

图１邋Ａ：原代培养的ｈＰＤＬＣｓ，第７ｄ，１０0ｘ邋Ｂ：邋ｈＰＤＬＣｓ传代后，第三代，１０0ｘ邋Ｃ：免逡逑疫荧光显示波形蛋白表达阳性２０0ｘ邋Ｄ：免疫荧光显示角形蛋白表达阴性２０0ｘ邋Ｅ：逡逑ｈＰＤＬＣｓ形成的细胞团簇，４0ｘ邋Ｆ：茜素红染色２０0ｘ邋Ｇ：油红０染色２０0ｘ逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ａ：邋ｈＰＤＬＣｓ邋ｇｒｅｗ邋ｒａｄｉａｌｌｙ邋ａｒｏｕｎｄ邋ｔｈｅ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｂｌｏｃｋ邋４0ｘ邋Ｂ：邋ｃｅｌｌ邋ｇｒｅｗ邋ｗｅｌｌ邋ａｆｔｅｒ逡逑

依普黄酮,蛋白质水平,表达水平,信号通路

图４在蛋白质水平（Ａ）和ｍＲＮＡ水平（Ｂ）中，依普黄酮均增加ＡＬＰ，Ｒｕｎｘ２，逡逑ＧＰＲ３０的表达水平。（Ｃ）邋ｐ－ＡＫＴ表达升高而ＡＫＴ总蛋白表达不变证明ＰＩ３Ｋ逡逑／Ａｋｔ信号通路被依普黄酮激活＊Ｐ＜０．０５；邋＊＊邋Ｐ＜０．０１；邋＊＊＊邋Ｐ０．００１逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋４邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＡＬＰ？邋Ｒｕｎｘ２，邋ＧＰＲ３０邋ｗｅｒｅ邋ａｌｌ邋ｉｎｃｒｅａｓｅｄ邋ｂｙ邋ＩＰ邋ｉｎ邋ｂｏｔｈ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑

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