Sub-MICs抗菌剂对变异链球菌生物膜形成能力影响的初步研究

发布时间：2020-06-26 05:59

【摘要】：许多研究已经证实抗菌剂在亚最低抑菌浓度（sub-minimal inhibitoryconcentrations, sub-MICs）下能够抑制细菌生物膜的形成，然而，sub-MICs抗菌剂抑制生物膜形成的机制仍不清楚。目前，大部分的研究都集中于研究G-菌，而sub-MICs抗菌剂对G+菌的调节可能更复杂。变异链球菌(Streptococcus mutans, S. mutans,以下简称变链菌)是一种主要的致龋微生物。本研究测定了在洗必泰、茶多酚及氟化钠三种常见抗菌剂1/2MICs浓度下处理后的变链菌生长曲线以及与变链菌形成生物膜相关的基因的相对表达量，并利用Bioflux系统形成一定流速状态下的生物膜来观察在剪切力作用下所形成的生物膜的形态特点。此外本研究还用场发射扫描电子显微镜（Field Emission Scanning Electron Microscopy, FE-SEM）及激光共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）对变链菌的形态学改变进行了观察和分析。实验结果显示，这三种常见的抗菌剂均能够明显上调与变链菌生物膜形成相关的基因表达，而且经过sub-MICs氟化钠和洗必泰处理过的变链菌形成了具有大量细胞外基质的致密生物膜。表明sub-MICs的抗菌剂能够增强变链菌生物膜的形成，这可能不利于龋病的控制。本实验共分为五个部分第一部分：抗菌剂对变异链球菌最小抑菌浓度（MIC）及最小杀菌浓度（MBC）测定将氟化钠、茶多酚、洗必泰、甲硝唑及青霉素五种抗菌剂粉剂分别按比例溶于无菌三蒸水中，过滤消毒。将冻存的变链菌菌株UA159复苏，用二倍稀释法测定这五种抗菌剂对变链菌的MIC，同时铺板计数确定其MBC。结果显示上述五种抗菌剂均对变链菌有一定的抑菌性，除了洗必泰的MIC和MBC一样外，其余抗菌剂的MBC均比MIC高。第二部分：Sub-MICs抗菌剂对变异链球菌生长曲线的影响将1/2MICs的抗菌剂分别与变链菌制成混悬液，37℃恒温厌氧培养，分别于0，2，4，6，8，10，12，24，48h取样，用酶标仪测其OD600值，同时做活菌计数，用这两组数据同时绘制生长曲线。结果显示氟化钠的抑菌性最强，青霉素和洗必泰次之，甲硝唑和茶多酚的作用最弱，接近对照组。第三部分：Sub-MICs抗菌剂作用下变异链球菌生物膜相关基因的相对表达量分析设计用于RT-PCR的引物。将实验分为两组，分别是浮游态组和生物膜组，将1/2MICs的各抗菌剂分别与变链菌一起37℃恒温厌氧培养，浮游态组置于试管内，生物膜组置于24孔板内并在培养液中加入1%的蔗糖，24h后取样，提取RNA，反转录，RT-PCR测定相关基因的表达量。结果显示几乎所有的实验基因均发生高表达。这说明sub-MICs的抗菌剂可促进生物膜相关基因的表达。第四部分：Sub-MICs抗菌剂作用后变异链球菌的形态学改变的FE-SEM观察将健康离体牙切成2mm厚釉质块，75%酒精浸泡30min灭菌消毒。将1/2MICs抗菌剂分别与变链菌一起置于24孔板中，在培养液中加入1%的蔗糖，同时置入釉质片，37℃恒温厌氧培养，24h后取出釉质块，通过洗涤、固定、脱水、干燥以及喷金处理后，在FE-SEM下观察变链菌的形态学变化，结果显示，比起对照组，氟化钠组和洗必泰组的变链菌表面的细胞外基质增多，生物膜更致密，孔隙减少；而茶多酚组的变链菌表面只能看到堆积的细菌及极少数的细胞外基质。提示氟化钠和洗必泰可能促进了变链菌生物膜的形成，而茶多酚则可能通过抑制变链菌胞外基质的合成，从而抑制了生物膜的形成。第五部分： Sub-MICs抗菌剂作用下变异链球菌在Bioflux系统下形成生物膜形态的CLSM观察将1/2MIC的氟化钠、洗必泰及茶多酚分别与一定量的变链菌菌悬液混合，并在混悬液中加入1%的蔗糖，然后将其分别置于BioFlux系统中在剪切力下培养15h后形成生物膜，用死/活菌荧光染料染色，CLSM下观察。结果显示对照组形成的生物膜内部有大量的细胞空腔；而氟化钠组和洗必泰组形成的生物膜只能看到极少量的水通道；茶多酚组无明显的生物膜形成。这结果与第四部分的实验结果相符合，均提示氟化钠和洗必泰可能促进了变链菌生物膜的形成，而茶多酚则可能抑制了其形成。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R780.2
【图文】：

信号传导通路

基因表型[21]。到目前为止，QS 系统在 G-菌研究的比较多，而对于 G+菌来说，则研究的相对较少。目前，对于变链菌种属内的密度感应系统研究较多的是通过感受态刺激肽(competence stimulating peptide, CSP)介导的 QS 系统-ComAB/ComCDE 径(图 1)。CSP 信号分子是一种存在于多重基因路径的效应器，其中包括生物膜形成、细菌的耐酸性、细菌素的产生和细菌的毒力性等[22]。comAB 操纵子编码的是 ComA 和 ComB 蛋白，其中 ComA 蛋白是一能够与 ATP 相结合的传输体，而 ComB 蛋白则与 CSP 的加工及输出有关comCDE 操纵子编码的则是合成 CSP 的前体(ComC)、CSP 感受器(ComD)以及一个与 ComD 具有同源性的反应调节子(ComE)。comX 基因编码的是

生物膜,基因,引物设计,中模

2 95℃ 15 秒 PCR 循环中模× 3 60℃ 30 秒退火4 68℃ 60 秒延伸电泳成像仪下观察到的变链菌生物膜形成相关基因普示。图 2 中我们可以看到，从左到右分别是 Marker，16sComD，ComE，可以看出这几条条带都比较清楚，无引物相吻合，说明引物设计正确，退火温度适合。

【参考文献】