人牙髓细胞向成牙本质细胞方向诱导分化相关miRNA的筛选

发布时间：2020-06-27 10:01

【摘要】：背景microRNAs(miRNAs)是小的非编码RNA,长度约20~22bp,由基因组转录,通过和靶基因mRNA碱基配对,引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻译,从而在转录水平调控蛋白表达。作为机体内源性RNA,同时作为可对基因表达进行微调的分子,其可能参与了生物体的生长、发育、衰老及死亡的调控,近年来其在细胞增殖及分化中的意义引起广泛关注。miRNA在多种细胞中均有表达,它通过负向调节细胞中某些关键基因的表达,对细胞的分化起调控作用[1.2.3]。牙髓组织在牙齿的营养代谢、感觉、修复等生理功能方面发挥着重要的作用,深入研究牙髓,有助于我们了解牙髓细胞的分化、牙髓钙化、牙本质形成以及相关的调节因素。牙髓细胞经诱导可向成牙本质细胞分化并形成牙本质样结构,预示了其在牙本质再生中作为种子细胞的应用前景。目的通过检测牙髓细胞及其诱导分化的成牙本质细胞中miRNA基因的表达谱,筛选出诱导分化前后细胞表达的差异性miRNAs,并预测其可能靶基因,寻找可能的人牙髓细胞成牙本质分化特异性的miRNAs,并进行验证,为进一步探讨miRNAs对HDPCs生物学功能的调控作用提供实验基础。材料与方法(1)采用酶消化法+组织块法分离培养人牙髓细胞,通过观察原代及传代HDPCs的形态特点,免疫化学检测细胞表面标志物,对人牙髓细胞进行鉴定;(2)采用地塞米松、b甘油磷酸钠和维生素C联合诱导HDPCs向成牙本质细胞方向分化,检测其碱性磷酸酶活性;(3)利用miRNA基因芯片技术,检测了人牙髓细胞及其诱导分化的成牙本质细胞中miRNAs的表达谱,分析并筛选在HDPCs分化过程中差异表达的miRNA,并通过miRGen数据库预测其靶基因;(4)采用半定量RT-PCR的方法,对miRNA基因芯片筛选出的人DPCs及其诱导分化的成牙本质细胞的差异miRNA进行验证。结果(1)经酶消化法+组织块法联合培养所得的细胞,细胞表型免疫组化鉴定:波形蛋白、I型胶原表达阳性。(2)牙髓细胞在含地塞米松、?-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养基中可诱导分化为成牙本质细胞,形成钙化结节,碱性磷酸酶活性检测升高,钙化结节Von Kossa染色阳性表达。(3)利用基因芯片检测了人DPCs及其诱导分化的成牙本质细胞miRNAs的表达谱,筛选了差异表达的miRNAs,矿化诱导的HDPC较未诱导HDPC的表达谱比较,有72种miRNA发生1.5倍以上表达上调,61种miRNA发生1.5倍以上表达下调。(4)对筛选出的差异表达miRNAs通过miRNA靶标预测工具分析发现,带有靶标基因的miRNA有35个,35个miRNA的靶标基因总和1327个,miRNA和靶标基因关系对总共2158个。(5)选择hsa-miR-150用半定量RT-PCR进行验证,结果与芯片结果一致。结论(1)用组织块酶消化法可从人牙髓中分离得到人牙髓细胞,并可在体外培养将其诱导分化为成牙本质细胞。(2)在人牙髓细胞及其诱导分化的成牙本质细胞中均存在大量的miRNAs。(3)在人牙髓细胞及其诱导分化的成牙本质细胞中存在差异表达的miRNAs,它们可能对牙髓细胞的成牙本质分化起着重要的调控作用,即存在所谓的特异性miRNA.
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R781.3
【图文】：

凝胶电泳,靶标

系对。构建人所有的 miRNA 和它们调控的靶，取 4 个流行的 miRNA 靶标预测工具中的任意因存在靶标关系。针对每个GO和KEGG Pathw功能集中的数目，以及 136 个 miRNA 靶标基因子表，计算富积得分，该富积得分就是比值比检验计算统计上显著性程度 P 值，通过 BH（B来降低假阳性。组和未诱导组样品中 hsa-miR-210 RT-PCR 产物 4-1），hsa-miR-210 在诱导前后均有表达，但表诱导分化组，说明 hsa-miR-210 在成牙本质细胞

靶标,基因功能,差异表达

通过 miRNA 靶标预测工具分析牙髓细胞组和矿化诱导成牙本质细胞组 1个表达有显著性差异的 miRNA，发现带有靶标基因的 miRNA 有 35 个，35miRNA 的靶标基因总和 1327 个，miRNA 和靶标基因关系对总共 2158 个，针每个 GO 和 KEGG Pathway 计算 35 个 miRNA 靶标基因在该功能集中的数目，到差异 miRNA 的靶标基因体现的功能，主要集中在信号转导，细胞增殖，转调控等方面（图 4-2A、B、C、D）。A B3.2 差异表达 miRNA 靶基因的预测及功能富积分析结果

【参考文献】