BMP4靶向促成骨中药单体筛选及其促前成骨细胞增殖分化的相关研究

发布时间：2020-07-01 13:24

【摘要】：牙槽骨骨量不足可导致可摘义齿固位差、种植义齿修复困难等问题,因此,良好的牙槽骨骨量是修复成功的基础条件之一。在临床中,颌骨骨髓炎、颌骨囊肿、颌骨良恶性肿瘤、外伤以及缺牙区生理性的骨吸收,都可能导致牙槽骨量不足,这将给修复过程带来困难,并影响修复的远期效果。因此,寻找增加骨量的方法和途径成为研究热点。骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMPs)是转化生长因子β(TGF-β)超家族中的一员,许多器官在生长和发育的过程中都受到BMPs的调节。自1965年Urist和其他学者从脱钙骨中提取出具有促成骨活性的蛋白质成分以来,又陆续发现了多种骨形态发生蛋白,并发现其在成骨方面的重要作用。其中,BMP4对促进骨组织的形成和再生尤为重要。研究发现通过对骨髓间充质干细胞(BMSCs)和手术去势实现的小鼠骨质疏松模型研究发现,BMP4信号传导活化被抑制后,出现了明显的骨质疏松现象,揭示BMP4信号是骨组织再生和促成骨治疗方面的重要靶点;且BMP4信号具有促进成骨细胞由生长板向骨化中心的转移,相当于骨生长的持续动力;带有BMP4的骨修复材料在颅骨缺损的动物模型上也有显著的成骨优势。近年来,中医药在成骨方面的研究得到越来越多的关注,根据“肾主骨生髓”的理论,利用补肾中药来强身健体,是中医中药防治骨质疏松、促进成骨的理论基础。随着对中药研究的深入,越来越多的具有补肾效果的中药及中药单体均被证实了成骨效果。但因其混合组方的应用,其自身提取物的各种单体混合的特点,解决如何筛选出有效单体成分,进而进行靶向治疗,具有重要意义。我们利用课题组前期已制备成功的pGL2-BMP4启动子荧光素酶报告基因重组质粒,对多种具有补肾功效的中药单体进行促进BMP4启动子转录的药物筛选;随后,通过western blot实验检测这些中药对BMP4蛋白表达的调节作用。通过上述实验,我们发现,五味子丙素在促进BMP4的启动子转录和蛋白表达方面效果显著。随后,我们设计了进一步的浓度梯度实验,通过荧光素酶报告基因筛选和Western Blot筛选,发现10-8M为五味子丙素促进BMP4的启动子转录和蛋白表达最佳作用浓度。进而为了验证五味子丙素对Mc3T3-E1细胞的增殖和分化的促进作用,我们设计了MTT实验和ALP检测实验。检测发现:在促增殖方面,给药后的第一天和第二天,给药组与未给药组未见显著差异;从第三天,给药组的OD值明显高于优于未给药组(P0.05),说明五味子丙素对Mc3T3-E1细胞具有一定的促增殖效果;在促进分化方面,以ALP作为分化的检测指标进行检测,我们发现给药组ALP活性均高于未给药组,且在第三天时出现显著差异(P0.05),证实了五味子丙素对Mc3T3-E1细胞具有一定的促分化效果。为了探究BMP4是否是五味子丙素促进Mc3T3-E1细胞增殖分化的作用靶点,我们进行了BMP4基因沉默实验。我们发现,沉默BMP4基因后,五味子丙素对促增殖的效果明显降低,在ALP活性检测中也得到了同样的结果。因此,我们推测,上调BMP4表达是五味子丙素促进前成骨细胞增殖和分化的可能途径。通过上述实验,我们得出结论,五味子丙素可以促进BMP4启动子转录和BMP4蛋白表达,其中10-8M的浓度效果最为明显。五味子丙素可促进前成骨细胞的增殖和分化,上调BMP4表达是五味子丙素促进前成骨细胞增殖和分化的可能途径。本实验为应用中药单体进行促成骨治疗的临床应用提供了新思路。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R78
【图文】：

３．１邋ｐＧＬ２－ＢＭＰ４重组质粒酶切鉴定逡逑原有的ＰＧＬ２－ＢＭＰ４重组质粒经过转化扩增、小量培养、大量培养、大量提逡逑取后，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。如图４．１逡逑Ｉ逡逑／邋／逡逑图４．１邋ｐＧＬ２－ＢＭＰ４重组质粒酶切结果逡逑３．２中药单体五味子丙素可促进ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞ＢＭＰ４启动子的逡逑转录逡逑通过文献查阅以及前期预实验的初步筛选，我们利用双荧光素酶检测报告系逡逑统试剂盒对地黄苷Ｄ、芦荟大黄素、延胡索甲素、五味子丙素、原阿片碱、姜黄逡逑素、灵傮＿Ａ、大黄酚、人参皂甘Ｒｂｌ等中药单体进行检测。按着说明书要求，逡逑在ＨＥＫ２９３Ｔ细胞中转染ｐＧＬ２－ＢＭＰ４和内参质粒ｐＲＥＰ７－Ｒｌｕｃ；邋１６ｈ后，加入上逡逑述中药单体，使加入药物后孔内的终浓度达到１０＿８Ｍ，并以ＰＢＳ作为对照，每个逡逑组设置６个平行孔；加药后２４ｈ进行测值。我们发现，相较于对照组，五味子丙逡逑素、地黄苷Ｄ、灵芝酸Ａ、大黄酚等中药单体均可以促进ＢＭＰ４启动子的转录，逡逑其中以五味子丙素效果显著（ＰＯ．０１）。见图４．２。逡逑１６逡逑

使加入药物后孔内的终浓度达到１（Ｔ８Ｍ，，并以ＰＢＳ作为对照；加药后４８ｈ收样；逡逑以（３－ａｃｔｉｎ作为内对照。我们发现，在这几种中药单体中，五味子丙素对ＢＭＰ４逡逑蛋白表达的促进作用最为显著。见图４．３。逡逑ＢＭＰ４逦—邋一、逡逑ｐ－ａｃｔｉｎ逡逑零，辨ｙ逡逑图４．３不同中药单体对ＢＭＰ４蛋白表达的影响逡逑３．４五味子丙素在１０＿８Ｍ浓度时促ＢＭＰ４启动子转录活性效果最逡逑为明显逦１７逡逑

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本文编号：2736813