甲状旁腺激素与低渗透压联合调控成骨样细胞MG63生物学效应的研究

发布时间：2020-07-02 12:18

【摘要】： 随着人口老龄化问题日益严重，口腔修复患者中原发性骨质疏松症的老年患者越来越多。由于骨质疏松导致骨量不足、骨密度过低，不能进行正常的种植修复，或者常规修复效果不理想。如何治疗和控制骨质疏松的发病，解决因此带来的骨量不足，重建骨组织的健康结构和功能，是口腔医学，骨整形、以及骨缺损重建等临床医学所关心的问题。甲状旁腺激素(PTH)是一种重要的体内维持钙稳态及骨代谢的全身性调节激素，其靶细胞为成骨细胞和肾小管细胞。2002年12月，Forteo商品名叫特立派汰的人工合成PTH被FDA认证，作为治疗骨质疏松药物。研究证明，PTH对依据给药方式不同对骨组织产生双重作用。小剂量、间断式甲状旁腺激素(PTH)皮下注射能有效地促进骨骼合成；持续作用刺激骨转化，增加破骨细胞的活性和降低皮质骨量，导致松质骨丧失。PTH主要通过骨形成的三个阶段发挥作用的：1，刺激前期成骨细胞增殖；2，促进前期成骨细胞，但是抑制成熟的成骨细胞的分化；3，抑制成骨细胞凋亡。其中是否前期成骨细胞增殖提高还不是很清楚。PTH对骨组织的另一重作用是持续性大剂量注射PTH，则抑制成骨细胞增殖分化，活化破骨细胞。通过PTH以及应力对成骨细胞作用机制的研究发现，二者对成骨细胞的影响有很多共同的作用机理，这预示PTH和机械应力之间可能有着某种协同关系。有关PTH对成骨样细胞的机械应力响应的调节作用的基础研究，目前还未见国内报道。因此，有必要对PTH调控成骨样细胞的机械响应机制作进一步的研究，并寻求发现PTH和机械应力间的内在联系。目的：本课题旨在通过对体外培养的人成骨样细胞MG63，加载不同强度的牵张刺激，通过测定不同刺激强度对该细胞的线粒体跨膜电位(Δψ，m)、ALPase、细胞增殖及细胞内钙离子浓度的变化，初步筛选出一个牵张阈值；进而采用低浓度的甲状旁腺激素(20ng／ml)，采用间断和持续作用于阈上刺激后的人成骨样细胞MG63，通过观察其矿化结节的形成情况，以及采用RT-PCR技术检测人甲状旁腺激素相关蛋白(PHT／PTHrP)和骨钙素(OCN)的mRNA表达情况，初步探讨甲状旁腺激素对不同机械力作用下的成骨样细胞的生物学效应。以期探讨通过全身或局部药物作用，来影响机械载荷下的牙槽骨改建，预防或减缓其吸收。为口腔修复、种植和正畸临床医学提供基础性的研究。方法： 1．采用低渗透液式加力方式，对体外培养的细胞进行牵张刺激。采用不同浓度的甘露醇调节低渗透压的大小，模拟体外细胞受力的强度。 2．采用人成骨样细胞MG63的细胞株进行体外培养，观察细胞形态，绘制细胞生长曲线为低渗透压加载实验准备实验细胞。 3．采用低渗透压对体外培养的MG63进行加载，通过激光扫描共聚焦显微镜观测细胞线粒体形态，图像分析软件分析线粒体跨膜电位的变化；通过分析ALP以及细胞内钙离子浓度的变化分析低渗透压对MG63的影响，初步筛选出一个低渗透压阈值，为后期PTH实验研究准备实验条件。 4．采用化学荧光检测技术，对加入细胞培养基中不同时间的PTH的免疫活性进行药物动力学检测，分析PTH的代谢特性，并绘制代谢曲线。排除由于PTH代谢导致药效浓度过低，可能产生的实验结果的偏差。 5．对阈上刺激后的MG63进行低浓度的PTH间断和连续刺激，采用RT-PCR技术检测细胞内甲状旁腺激素相关蛋白PHT／PTHrP和骨钙素OCN的mRNA表达情况。 6．采用茜素红染色技术，观察PTH作用前后的MG63矿化诱导情况，并采用分光光度仪定量检测钙化结节的情况。结果： 1．通过对线粒体膜电位的检测发现，随着渗透压的降低，以及作用的时间延长，膜电位有增高的趋势，其中277mOsm膜电位轻度增高，但与对照组没有明显差别(P＞0.05)；240mOsm组的膜电位总体高于对照组(P＜0.05)，且作用2h、4h和6h时，膜电位明显高于对照组，在作用4h时达到峰值。163mOsm在作用初期，就有明显的膜电位增高，但是随着作用时间的延长，膜电位降低，且作用4h以后，已经明显低于对照组(P＜0.05)。 2．通过MTT生长曲线分析发现所有细胞均近似“s”形，有明显的滞留期、指数生长期、平台期。随着渗透压的降低，细胞滞留期变短，对数生长期提前，较早进入平台期。 3．通过对低渗压作用后的MG63的ALP，以及胞内钙离子浓度〔Ca~(2+)〕_i变化分析发现，低渗处理组中，277mOsm、240mOsm和163mOsm组早期ALP活性降低，以后随着作用时间延长，有所增加，但是仍然低于对照组。三个低渗处理组中各时间组的〔Ca~(2+)〕_i均高于对照组(P＜0.05)，且随着作用时间延长也是呈现增高趋势，分别在24h、12h和8h达到峰值，以后逐渐回落，但是仍然明显高于对照组。 4．通过对PTH药物动力学研究发现，在实验设计的观测期内(24h)，PTH的免疫活性没有明显降低。说明实验设计的观测期合理，排除了实验结果是由于激素代谢导致药效降低引起的误差。 5．PTH对成骨样细胞MG63的矿化影响具有时间依赖性，与药物浓度关系不大。 6．间断使用PTH和牵张力具有刺激成骨样细胞MG63增殖分化的作用；小剂量、间断PTH刺激应力状态下的成骨样细胞6h，PTHrPmRNA高表达，OCmRNA表达受到抑制。刺激3h则PTHrPmRNA的表达降低，而OCmRNA表达轻度升高；作用1h则PTHrPmRNA和OCmRNA的表达与对照组没有明显差异；相反PTH连续作用24h时，PTHrPmRNA和OCmRNA的表达均明显降低。 7．间断低浓度使用hPTH1-34，有助于应力载荷后的成骨增殖活力的恢复，缓解过载荷状态下成骨细胞的增殖抑制，利于基质骨矿化的形成；且加强地塞米松的成骨诱导作用结论： 1．低渗透液作为一种应用于研究细胞离子通道的加力方式，同样可以适用于研究细胞体外受力的生物学特性。其随着渗透压的逐渐降低，对成骨样细胞所产生的作用效果，与以往采用四点弯曲等加载方式有着一定的相似作用趋势。 2．采用低渗透液进行细胞体外受力研究发现，在一定条件下(270～240mOsm，作用4—6小时)，对成骨样细胞MG63具有促进增殖分化的作用，过强(163mOsm，作用4—6小时)、过小(270mOsm，作用0.5—2小时)的应力都不利于该细胞成熟分化。 3．对阈上刺激后的MG63，采用小剂量(20ng／ml) hPTH1-34的间断诱导，具有调节PTHrPmRNA和OCmRNA的表达的作用。其中对阈上刺激后4h，PTH间断作用6h，细胞的PTHrPmRNA的表达明显增高，OCmRNA的表达则受到一定的抑制作用。结合胞内游离钙浓度的变化，说明两种基因表达的变化可能与胞内钙离子通道有关。同时，该实验条件下的细胞矿化诱导后基质的矿化结节形成增多。也提示hPTH1-34对阈上刺激后的MG63的影响与钙离子通道之间有一定的关系。 4．现有细胞学实验，为动物应力损伤实验奠定了基础，将有助于更深层次的了解PTH对骨组织机械学响应的影响作用。
【学位授予单位】：四川大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R783;R580

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