miR-146a-5p调控Hey2对成骨细胞炎症反应的影响

发布时间：2020-07-03 06:32

【摘要】：目的:慢性根尖周炎(chronic apical periodontitis,CAP)是指根管内长期存在感染及病原刺激物而导致的根尖周围组织慢性炎症反应,表现为炎症性肉芽组织的形成和牙槽骨的破坏。牙髓卟啉单胞菌(Porphyromonas endodontalis,P.endodontalis)是牙髓感染的特有病原菌,其脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是重要的毒力因子,可刺激细胞分泌大量致炎因子,如:白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)等,在局部发挥生物学效应。P.endodontalis LPS诱导成骨细胞产生的IL-6可以刺激成骨细胞产生其它炎症因子,促进破骨前体细胞分化,抑制成骨细胞活性,还可以直接与破骨细胞表面受体结合,引发破骨细胞反应。有研究表明,在LPS所诱导的细胞炎性反应中,miR-146a-5p通过抑制其靶基因肿瘤坏死因子受体相关因子-6(TNF receptor-associated factor-6,TRAF6)、白介素受体相关激酶-1(Interleukin receptor-associated kinase-1,IRAK1)的表达,减少下游炎症因子的释放,起到抑制炎症的作用,但miR-146a-5p是否参与到CAP的调控,是否在P.endodontalis LPS诱导的成骨细胞炎症中同样发挥抑炎的作用,尚未见报道。Hey(hairy and Enhancer-of-split related with YRPW motif,Hey)基因是转录因子超家族bHLH(碱性-螺旋-环-螺旋,basic-helix-loop-helix,bHLH)的一员,Hey2作为Notch信号通路的直接下游靶基因,参与心脏发育、血管生成、骨组织分化、牙齿发育及损伤后牙髓的再生与修复等生物学行为。前期利用生物信息学手段预测Hey2可能是miR-146a-5p一个潜在的靶基因,两者是否真的具有靶向作用,Hey2是否参与慢性根尖周炎的调控,在P.endodontalis LPS诱导成骨细胞炎症反应中发挥何种作用尚未见报道。综上所述,本研究以小鼠成骨细胞模型为主要研究对象,通过检测miR-146a-5p、Hey2在慢性根尖周炎中的表达,探讨在P.endodontalis LPS诱导成骨细胞炎症反应中miR-146a-5p、Hey2、IL-6三者的相互作用,以揭示在慢性根尖周炎中miR-146a-5p、Hey2的作用机制及意义,完善Hey2作为转录抑制因子在炎症反应中的调控机制,以期为慢性根尖周炎的治疗提供新的靶点。材料与方法:一、实验方法1、培养P.endodontalis,完成LPS的提取和鉴定。2、培养小鼠成骨细胞MC3T3-E1、SV40T转化的人胚肾细胞293T。3、取得伦理委员会批准及患者知情同意后,病例组共收集到20例根尖周病损组织样本,对照组共收集到13例健康牙的牙周膜组织样本。4、采用苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin,H-E)染色检测慢性根尖周炎组织的炎症浸润程度。5、采用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色检测慢性根尖周炎组织中Hey2蛋白的表达。6、将miR-146a-5p化学合成模拟物、抑制剂、Hey2过表达质粒转染至MC3T3-E1细胞。7、采用实时逆转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,real-time RT-PCR)方法检测各组miR-146a-5p、Hey2、IL-6 mRNA的相对表达情况。8、采用酶联免疫吸附实验(enzyme-like immunosorbent assay,ELISA)检测各组IL-6蛋白分泌情况。9、采用蛋白印迹(Western blot)方法检测各组Hey2蛋白水平的变化。10、在293T细胞中,通过双荧光素酶活性检测实验检测miR-146a-5p与Hey23‘UTR结合情况。11、采用染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)实验检测10μg/ml的P.endodontalis LPS作用MC3T3-E1细胞24 h后,Hey2蛋白与IL-6启动子的结合情况。二、统计方法每组实验至少重复3次,除患者性别比较采用Mann-Whitney U秩和检验外,其它所有实验数据均以均数±标准差表示,用SPSS 18.0软件建立数据库,采用单因素方差分析和Dunnett t检验进行统计学分析,以双侧P0.05为差异有统计学意义。结果:一、慢性根尖周炎组织中miR-146a-5p、Hey2的表达1、病损组织中存在大量炎症细胞浸润。2、Hey2定位在胞核及胞质中,在浆细胞、中性粒细胞及巨噬细胞中呈阳性表达。3、miR-146a-5p、Hey2在慢性根尖周炎病损组织中的相对表达量明显高于对照组健康牙周膜组织。二、miR-146a-5p与P.endodontalis LPS诱导MC3T3-E1细胞表达IL-6呈负相关性1、不同质量浓度的P.endodontalis LPS作用于MC3T3-E1细胞24 h,miR-146a-5p相对表达量显著升高,具有剂量依赖性;IL-6的表达也显著升高,最大值出现在10μg/mL组。2、10μg/mL质量浓度的P.endodontalis LPS作用于MC3T3-E1细胞不同时间,可诱导miR-146a-5p、IL-6表达升高,最大值出现在10 h组。3、在P.endodontalis LPS诱导MC3T3-E1细胞产生炎症反应过程中,过表达miR-146a-5p,IL-6的表达受到抑制;抑制miR-146a-5p后,IL-6的表达升高。三、miR-146a-5p靶向调控Hey2的机制研究1、P.endodontalis LPS诱导的MC3T3-E1细胞炎症反应中,miR-146a-5p负向调控Hey2的表达;过表达Hey2后,miR-146a-5p的表达下降。2、双荧光素酶活性检测实验证实miR-146a-5p可以与Hey2 3’UTR区特定的位点结合,过表达miR-146a-5p后,可抑制Hey2 3’UTR WT组相对荧光素酶活性。四、Hey2抑制P.endodontalis LPS诱导MC3T3-E1细胞表达IL-61、5、10、15μg/mL质量浓度的P.endodontalis LPS可诱导MC3T3-E1细胞表达Hey2;当10μg/mL P.endodontalis LPS作用时间达到24、48 h,Hey2的表达显著升高。2、在P.endodontalis LPS作用下过表达Hey2,可以抑制IL-6的表达。3、10μg/ml P.endodontalis LPS刺激MC3T3-E1细胞24 h,促使Hey2绑定于IL-6启动子-400~-200 bp区域。结论:1、在慢性根尖周炎病损组织内可检测到miR-146a-5p、Hey2的表达,且表达量显著高于正常牙周膜组织,推测miR-146a-5p、Hey2可能参与慢性根尖周炎的发病过程。2、P.endodontalis LPS诱导的成骨细胞炎症反应中,miR-146a-5p与炎症因子IL-6的表达呈负相关性,推测miR-146a-5p起到抑制炎症的作用。3、miR-146a-5p与Hey2可以形成互补的负反馈环,miR-146a-5p与Hey2 3’UTR区特定的位点结合,证实Hey2是miR-146a-5p的靶基因之一。4、P.endodontalis LPS可以诱导MC3T3-E1细胞表达Hey2,Hey2通过与IL-6启动子区域绑定,抑制IL-6的表达,推测在成骨细胞炎症反应中Hey2可作为IL-6的转录抑制因子发挥作用。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R781.341
【图文】：

慢性根尖周炎,炎症

中国医科大学博士学位论文3 实验结果3.1 慢性根尖周炎组织中miR-146a-5p、Hey2 的表达3.1.1 H-E 染色检测慢性根尖周炎组织中炎症浸润程度H-E 染色结果可见，在正常牙周膜组织中，未见明显的炎症组织浸润（图 1A）；在根尖周炎病损组织中，大量炎性细胞浸润，主要包括：淋巴细胞、中性粒细胞、浆细胞及巨噬细胞等，还可见新生的毛细血管及红细胞（图 1B）。

慢性根尖周炎,免疫组织化学染色,病例

图 2 免疫组织化学染色检测慢性根尖周炎组织中 Hey2 蛋白的表达。A：对照组空白对照(×200)；B：病例组空白对照(×200)；C：Hey2 在健康牙周膜组量阳性表达(×200)；D：Hey2 在根尖周病损组织中的阳性表达(×200)；E：对照组细胞上有 Hey2 的少量表达(×400)；F.：病例组浆细胞、中性粒细胞及巨噬细胞中达如箭头所示(×400)。3 Real-Time RT-PCR 检测慢性根尖周炎组织中 miR-146a-5p、Hey2 mRNA达量共有20例患者符合标准纳入病例组，其中女12人，男8人，平均年龄48.5 有 13 例健康志愿者符合标准纳入对照组，其中女 8 人，男 5 人，平均年龄.8 岁。两组年龄经 Dunnett t 检验无显著性差异（P>0.05），性别的差n-Whitney U 秩和检验无统计学意义（P>0.05），两组的数据具有可比l-Time RT-PCR 结果显示，病例组与对照组均有 miR-146a-5p、Hey2 mRNA

【参考文献】