硫酸乙酰肝素蛋白多糖与涎腺腺样囊性癌肺转移关系的研究

发布时间：2020-07-04 13:35

【摘要】：目的: 涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma, SACC）是最常见的涎腺恶性肿瘤，约占涎腺恶性肿瘤的22%。此肿瘤无包膜，侵袭性很强。嗜神经生长和远处转移是涎腺腺样囊性癌的两大恶性生物学特性，其中肺脏是涎腺腺样囊性癌远处转移最常发生的部位，也是临床上涎腺腺样囊性癌患者死亡的主要原因之一。涎腺腺样囊性癌由肿瘤性肌上皮细胞（neoplastic myoepithelial cells,NMCs）和肿瘤性腺上皮细胞构成。肿瘤性肌上皮细胞具有双向分化的特征，它不仅具有正常肌上皮细胞的收缩功能，还具有平滑肌分泌蛋白多糖（proteoglycans, PGs）的功能。蛋白多糖分布于涎腺腺样囊性癌肿瘤细胞团块中，形成大小不等的囊样腔隙，呈筛孔状分布于肿瘤实质区，形成了涎腺腺样囊性癌特征性的组织学结构。蛋白多糖为涎腺腺样囊性癌的生长提供必要的营养来源。硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans, HSPGs）是一类由核心蛋白和（乙酰）硫酸肝素（heparan sulfate, HS）多糖链组成的蛋白多糖的总称。根据核心蛋白结构的不同，HSPGs主要包括位于细胞膜表面的磷脂酰肌醇蛋白多糖家族（glypicans, GPCs）和多配体蛋白多糖家族（syndecans, SDCs），以及位于细胞外基质中的基膜蛋白多糖（perlecan/HSPG2）、XVIII型胶原和集聚蛋白多糖（agrin）。GPCs家族包括六个成员：GPC1、GPC2、GPC3、GPC4、GPC5、GPC6；SDCs家族包括四个成员：SDC1、SDC2、SDC3、SDC4。以往的研究表明，HSPGs广泛分布于涎腺腺样囊性癌肿瘤细胞及细胞外基质。并可作为受体、共受体参与细胞增殖、细胞粘附、基质聚集、凝血等正常生理过程，也参与伤口愈合、炎症、肿瘤细胞的迁移及侵袭等过程。本研究拟检测HSPGs，包括细胞膜HSPGs（SDCs家族和GPCs家族）与基膜HSPG（perlecan），在涎腺腺样囊性癌高转移细胞株SACC-M、低转移细胞株SACC-2、涎腺腺样囊性癌细胞株SACC-83及伴或不伴有肺转移涎腺腺样囊性癌组织中的表达，并分析探讨HSPGs异常表达，在涎腺腺样囊性癌肺转移过程中的作用。方法：第一部分硫酸乙酰肝素蛋白多糖在涎腺腺样囊性癌中的表达 1HSPGs在涎腺腺样囊性癌细胞株中的表达本部分研究选择以下细胞株：涎腺腺样囊性癌高转移细胞株SACC-M；涎腺腺样囊性癌低转移细胞株SACC-2；涎腺腺样囊性癌细胞株SACC-83。 1.1涎腺腺样囊性癌SACC-M、SACC-2、SACC-83的细胞培养将SACC-M、SACC-2、SACC-83细胞培养于含15%胎牛血清的RPMI-1640培养液（100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，pH值为7.2）中，于37C、5%CO_2饱和湿度培养箱中培养。 1.2细胞总RNA提取 Trizol法分别提取SACC-M、SACC-2、SACC-83细胞总RNA；分光光度计260nm及280nm波长检测RNA纯度及浓度； 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。 1.3反转录合成第一链cDNA 应用反转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成第一链cDNA。 1.4Real-Time PCR检测本研究采用Real-Time PCR（CT相对定量法）检测主要HSPGs，两大细胞膜HSPGs（SDCs家族和GPCs家族）与基膜HSPG（perlecan），在涎腺腺样囊性癌不同细胞株（SACC-M、SACC-2、SACC-83）的相对表达水平。 2检测GPC5蛋白在涎腺腺样囊性癌细胞株中的表达本部分研究根据前述实验结果，选择高表达的硫酸乙酰肝素蛋白多糖——GPC5作为研究目的基因，检测其在不同转移潜能的涎腺腺样囊性癌细胞株中的表达。 2.1免疫荧光细胞化学检测采用兔抗人GPC5单克隆抗体，通过免疫荧光细胞化学法检测GPC5蛋白在涎腺腺样囊性癌细胞株SACC-M、SACC-2和SACC-83细胞中的表达与分布。 2.2Western blot检测采用鼠抗人GPC5单克隆抗体，通过Western blot检测GPC5蛋白在SACC-M、SACC-2、SACC-83细胞中的相对表达量。 3检测GPC5蛋白在伴或不伴有肺转移涎腺腺样囊性癌中的表达收集临床涎腺腺样囊性癌16例，其中肺转移5例，无肺转移11例。免疫组织化学法检测GPC5蛋白在涎腺腺样囊性癌肿瘤组织中的表达，观察分析伴或不伴有肺转移涎腺腺样囊性癌肿瘤中GPC5蛋白的表达差异。第二部分靶向沉默人GPC5基因miRNA干扰质粒的构建 1miRNA干扰载体的设计及构建针对靶基因（human GPC5, Gene ID:2262）设计干扰序列并合成一套miRNA干扰载体。一套miRNA干扰载体包含4个miRNA oligos，以及阴性对照序列Oligo，退火后序列亚克隆到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体。 2测序验证每个转化平板分别挑取3个克隆，摇菌抽提质粒后进行测序，以验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的序列一致。 3质粒中量抽提 4质粒靶向沉默效果的鉴定脂质体LipofectamineTM2000介导质粒转染SACC-M细胞，Real-TimePCR（CT相对定量法）检测4个构建质粒的沉默效率。第三部分沉默人GPC5基因表达对涎腺腺样囊性癌肺转移作用的研究 1试验分组基因沉默组：GPC5-silenced，GPC5干扰质粒转染SACC-M细胞组；阴性对照组：GPC5-NC，阴性对照质粒NC转染SACC-M细胞组；空白对照组：SACC-M，未转染质粒的SACC-M细胞组。 2建立稳定沉默人GPC5基因细胞株 2.1SACC-M细胞培养，确定杀稻瘟菌素对SACC-M细胞的最小致死浓度及筛选浓度。 2.2通过脂质体LipofectamineTM2000介导靶向沉默GPC5基因的miRNA质粒转染SACC-M细胞，并利用药物（杀稻瘟菌素）筛选单克隆，建立稳定沉默人GPC5基因表达的细胞株（GPC5-silenced细胞），同时转染阴性对照质粒（NC质粒）进入SACC-M细胞株，建立阴性对照细胞株（GPC5-NC细胞）。 2.3质粒靶向沉默效率的鉴定 mRNA水平鉴定：Real-Time PCR检测GPC5基因在GPC5-silenced、GPC5-NC、SACC-M细胞的表达；蛋白水平鉴定：Western blot检测GPC5蛋白在GPC5-silenced、GPC5-NC、SACC-M细胞的表达。 3涎腺腺样囊性癌肺转移体内抑制试验选择18只BLAB/C nu裸鼠，4周龄，雄性，随机分为3组，分别进行尾静脉注射GPC5-silenced细胞、GPC5-NC细胞和SACC-M细胞，2×107/ml×0.2ml/只。SPF条件下饲养，第4周麻醉处死，称重新鲜肺组织湿重。10%福尔马林固定，HE染色，光镜下观察，进行统计学分析。结果：第一部分硫酸乙酰肝素蛋白多糖在涎腺腺样囊性癌中的表达 1HSPGs在涎腺腺样囊性癌细胞株中的表达 Real-Time PCR相对定量（CT相对定量法）分析结果显示，与SACC-2细胞相比，11种主要HSPGs在SACC-M细胞中的表达，其中SDC2、GPC3、GPC5表达分别上调1.50、2.58、3.24倍；与SACC-83细胞相比，11种主要HSPGs在SACC-M细胞中的表达，其中SDC2和GPC5表达分别上调15.32倍和815.69倍。 GPC5在涎腺腺样囊性癌肺转移细胞株SACC-M细胞中的表达明显上调3倍以上。 2GPC5蛋白在SACC-M、SACC-2、SACC-83中的表达免疫荧光细胞化学法检测结果显示，GPC5蛋白在涎腺腺样囊性癌细胞株SACC-M、SACC-2、SACC-83中均有表达，其中在涎腺腺样囊性癌肺转移株SACC-M中表达最高，SACC-2表达次之，在SACC-83细胞中呈弱表达。另外，GPC5不仅在细胞膜表面有表达，而且在细胞浆部位亦有表达。 Western blot检测结果显示，GPC5蛋白在涎腺腺样囊性癌肺转移细胞株SACC-M中的表达是SACC-2的3.41倍，是SACC-83表达的675.00倍。 3GPC5蛋白在伴或不伴有肺转移涎腺腺样囊性癌原发肿瘤中的表达免疫组织化学检测结果显示，GPC5蛋白在涎腺腺样囊性癌肿瘤组织中表达，主要沉积在肿瘤细胞的细胞膜、细胞浆。另外，在部分假性囊腔和腺腔内细胞外基质中也有沉积。且GPC5蛋白在伴有肺转移的涎腺腺样囊性癌组织表达明显高于不伴有肺转移的肿瘤，差别具有显著性（P 0.05）。第二部分靶向沉默人GPC5基因miRNA干扰质粒的构建 1构建靶向沉默GPC5基因的miRNA干扰质粒成功构建靶向沉默GPC5基因的miRNA干扰质粒12MR0055-1-1、12MR0055-2-1、12MR0055-3-1、12MR0055-4-2及阴性对照质粒NC，并进行测序验证； 2质粒靶向沉默效率的鉴定脂质体介导质粒12MR0055-1-1、12MR0055-2-1、12MR0055-3-1、12MR0055-4-2及NC转染SACC-M细胞。质粒转染48小时后，均可见有绿色荧光蛋白表达，分别收集细胞并提取细胞总RNA，Real-Time PCR检测结果显示，质粒12MR0055-1-1、12MR0055-2-1、12MR0055-3-1、12MR0055-4-2对靶基因GPC5的沉默效率分别达到80.5%、78.1%、80.3%、89.7%。第三部分沉默人GPC5基因表达对涎腺腺样囊性癌肺转移作用的研究 1建立稳定沉默GPC5基因的细胞株通过脂质体介导miRNA质粒成功转染SACC-M细胞株，在基因转染48小时，加入杀稻瘟菌素，进行药物筛选，建立靶向沉默GPC5基因的稳定细胞株GPC5-silenced，以及阴性对照细胞株GPC5-NC。 mRNA水平检测结果显示沉默效率达到89.7%；蛋白水平检测结果显示沉默效率达到96.5%。 2涎腺腺样囊性癌肺转移体内抑制试验裸鼠肺转移试验结果显示，GPC5基因沉默组（GPC5-silenced）裸鼠肺转移2例（转移率33.33%），阴性对照组（GPC5-NC组）裸鼠发生肺转移6例（100%），空白对照组SACC-M组裸鼠肺转移6例（100%），GPC5-silenced组与GPC5-NC组、SACC-M组相比，差异具有显著性（P 0.05）；GPC5-NC组与SACC-M组比较，差异没有统计学意义（P0.05）。新鲜肺组织湿重，GPC5基因沉默组（GPC5-silenced组）肺湿重（0.507±0.223g）明显低于阴性对照GPC5-NC组（1.177±0.342g）和空白对照SACC-M组（1.045±0.539g），差异具有显著性（P 0.05）；GPC5-NC组与SACC-M组比较，差别无显著性（P0.05）。形态学观察发现，SACC-M组和GPC5-NC组中正常肺组织结构消失，双肺内充满肿瘤细胞转移灶，肿瘤灶呈圆形或椭圆形。肿瘤细胞排列成致密的实性团块。肿瘤细胞圆形或多边性，排列紧密，胞浆嗜伊红染色，着色较浅，细胞胞核呈圆形，核分裂像多见，细胞核异型性明显。另外，肺组织内可见大量毛细血管扩张、充血。GPC5-silenced组2个肺转移标本中，正常肺组织结构清晰，偶见散在分布的肿瘤转移灶，且体积较SACC-M组及GPC5-NC组转移灶小，包膜不完整包膜。其余4个肺组织未见转移，肺组织结构正常。结论：硫酸乙酰肝素蛋白多糖GPC5基因高表达，能够增强涎腺腺样囊性癌肺转移的能力。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R739.8

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