人口腔鳞状细胞癌差异表达lncRNA转录组学分析及相关功能验证

发布时间：2020-07-07 01:46

【摘要】：口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)的侵袭性强,死亡率较高。虽然OSCC的诊治已取得很突出的成绩,但是中晚期患者生存质量仍然很差。为了扩展OSCC的治疗手段和提高OSCC患者的生存期,探索OSCC发病的分子机制、寻找诊断及预后的生物标志物以及治疗靶点的研究是目前亟待解决的课题。近些年,基因组微阵列以及全基因组测序技术的进步,提供了基因的基因组学证据,利于从整体的角度全面研究基因。研究者发现非编码RNA在机体生长、发育及病理方面发挥了重要作用,尤其是长链非编码RN A(long non-coding RNA,LncRNA)调控着恶性肿瘤的发病、转移以及复发,甚至参与了肿瘤的耐药。因此,有必要深入探讨lncRNA在OSCC发病过程中的作用机制。为此,我们应用lncRNA表达谱芯片对OSCC和对应正常组织样本中的lncRNA进行筛选,以期发现OSCC中差异表达的lncRNA;根据构建差异表达基因的共表达网络,发掘OSCC发病过程中节点lncRNA,分析其与OSCC临床病理资料的关系;选取共表达网络中的lncRNA进行细胞功能实验,观察其对OSCC细胞的增殖、侵袭、凋亡等生物学行为的影响,并初步研究其可能机制。本次研究将有助于揭示OSCC的发病机制,同时也为OSCC的诊断、预后的生物标志物及靶向治疗药物的寻找与开发提供实验基础。第一部分人口腔鳞状细胞癌lncRNA差异表达谱的筛选及验证目的:为探讨口腔鳞癌中lncRNA的表达情况,本实验应用lncRNA表达谱芯片检测口腔鳞癌中的lncRNA表达谱,明确lncRNAs和mRNAs在口腔鳞癌与正常组织中的表达是否存在差异。方法:提取3例口腔鳞癌患者的肿瘤组织和正常组织中的RNA,应用lnc RNA表达谱芯片构建口腔鳞癌中lnc RNA及m RNA差异表达谱,建立差异表达的lnc RNAs及m RNAs共表达网络。通过GO分析及KEGG富集分析,预测差异表达lnc RNAs的生物学功能。利用cis和trans调控,预测差异表达lnc RNAs的靶基因。选取部分差异表达的lnc RNAs,应用qRT-PCR验证芯片结果。结果:1.芯片筛选出2294条差异表达lnc RNAs(上调lnc RNAs为933条,下调lnc RNAs为1361条);1938条差异表达m RNAs(上调m RNAs为891条,下调m RNAs为1047条)。2.GO分析显示,差异表达基因分别在分子功能(MF)、生物过程(BP)和细胞成分(CC)中富集。其中,富集度排名前三位的是interleukin-1binding(GO:0019966;Ontology:molecular function;P=0.0003)、response to interferon-alpha(GO:0035455;Ontology:biological process;P=1.37E-10)、establishment of epithelial cell apical/basal polarity(GO:0045198;Ontology:biological process;P=0.0003)。KEGG通路分析显示,差异表达的m RNAs主要富集在38个生物学通路中。其中,很多通路与癌症相关,如“pathways in cancer”(富含36个差异表达基因),“bladder cancer”(富含8个差异表达基因),“metabolic pathways”(富含109个差异表达基因)、“pancreatic cancer”(富含11个差异表达基因)和“PPAR signaling pathway”(富含11个差异表达基因)。3.靶基因预测结果表明,1470个差异表达的lnc RNAs具有cis或trans调控靶基因。其中,1356个lnc RNAs作用于1250个cis靶基因,370个lnc RNAs作用于2454个trans靶基因,256个lnc RNAs既作用于cis靶基因又作用于trans靶基因。4.通过构建差异表达lnc RNAs和m RNAs的共表达网络,发现306个lnc RNAs与其他m RNAs和lnc RNAs发生着相互作用,其中TMPRSS11BNL、lnc-WRN-10:1为发生相互作用最多的基因,是整个网络的节点基因。5.选取10个差异表达的lnc RNAs,在72例口腔鳞癌及正常组织中进行qRT-PCR验证。结果显示,在口腔鳞癌中lnc-MANSC4-8:1、CXCR2P1、NRIR、lnc-CMPK2-1:3和lnc-GLI3-4:1显著上调,而TMPRSS11BNL、MEG3、lnc-WRN-10:1、DANCR和lnc-TPP2-7:2显著下调,说明验证结果和芯片结果一致。小结:1.实验筛选出2294条差异表达lnc RNAs和1938条差异表达m RNAs,下调表达基因多于上调表达基因。2.Lnc RNA TMPRSS11BNL、lnc-WRN-10:1是共表达网络的节点基因。3.qRT-PCR验证结果与芯片结果相一致,说明芯片结果可靠。第二部分人口腔鳞状细胞癌中长链非编码RNA TMPRSS11BNL、lnc-WRN-10:1的表达及意义目的:研究lnc RNA TMPRSS11BNL、lnc-WRN-10:1在口腔鳞癌和正常组织中的差异表达,分析其表达水平与口腔鳞癌临床病理特征之间的关系。方法:收集2015年01月-2016年10月在河北医大四院手术切除的72例患者的口腔鳞癌及对应正常组织,采用qRT-PCR方法检测lnc RNA TMPRSS11BNL、lnc-WRN-10:1的表达水平,分析其表达水平与临床病理特征及患者预后之间的关系。采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析,计量资料采用t检验,计数资料采用卡方检验,生存分析采用Kaplan-Meier方法并进行Log-rank检验,P0.05为差异有统计学意义。结果:1.Lnc RNA TMPRSS11BNL、lnc-WRN-10:1在口腔鳞癌中低表达。2.Lnc RNA TMPRSS11BNL、lnc-WRN-10:1表达水平与口腔鳞癌患者的年龄、性别、吸烟、肿瘤位置无关,与患者临床分期、淋巴结转移、远处转移和生存状态有关。3.Lnc RNA TMPRSS11BNL、lnc-WRN-10:1低表达的口腔鳞癌患者有着较短的无进展生存时间和总生存时间。小结:Lnc RNA TMPRSS11BNL、lnc-WRN-10:1在口腔鳞癌组织中低表达,并与患者临床分期、淋巴结转移、远处转移和生存状态有关。Lnc RNA TMPRSS11BNL、lnc-WRN-10:1低表达的口腔鳞癌患者有着较短的无进展生存时间和总生存时间。第三部分长链非编码RNA MEG3对口腔鳞状细胞癌Tca8113细胞生物学功能的影响目的:探讨lnc RNA MEG3对口腔鳞癌Tca8113细胞生物学功能的影响。方法:利用脂质体转染技术使lnc RNA MEG3在口腔鳞癌Tca8113细胞中过表达,通过MTT、Transwell迁移和侵袭实验、流式细胞技术测定口腔鳞癌Tca8113细胞增殖、迁移和侵袭、凋亡的变化。借助Western blot和qRT-PCR观察lnc RNA MEG3过表达对p53蛋白表达的影响。结果:1.Lnc RNA MEG3在口腔鳞癌Tca8113细胞中低表达。2.Lnc RNA MEG3过表达,可以显著抑制口腔鳞癌Tca8113细胞的增殖、迁移和侵袭的能力,诱导细胞凋亡,并促进p53蛋白的表达。小结:Lnc RNA MEG3在口腔鳞癌Tca8113细胞中过表达,可以显著抑制口腔鳞癌Tca8113细胞的生物学行为。结论:1.芯片筛选出2294条差异表达lnc RNAs和1938条差异表达m RNAs。下调表达基因多于上调表达基因,说明下调表达基因可能在口腔鳞癌发病过程中发挥更为重要作用。2.qRT-PCR验证结果与芯片结果相一致,提示芯片结果可靠。3.Lnc RNA TMPRSS11BNL、lnc-WRN-10:1可能是口腔鳞癌发病过程中关键节点基因,并与患者临床分期、淋巴结转移、远处转移和生存状态密切相关。4.Lnc RNA MEG3发挥着抑癌基因的作用,可以显著抑制口腔鳞癌Tca8113细胞的生物学活性。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.8
【图文】：

扫描图,正常组织,芯片,扫描图

1 Total RNA1%琼脂糖凝胶电泳结果（1，2，3-正常组织；4，5，6-腔鳞癌组织）ig.1 Results of total RNA1% agarose gel electrophoresis (1，2，3-Norma4，5，6-OSCC) LncRNA 芯片实验结果.1 LncRNA 芯片杂交扫描结果利用 Agilent Microarray Scanner 扫描杂交后的芯片，结果显示芯片信号分布均匀，强度较高，并且清晰，没有边缘化效应等情况。空白点无信号，阳性对照点和阴性对照点相应有强、弱信号，结果对比明见图 2）。

正常组织,琼脂糖凝胶电泳,边缘化,对照点

1%琼脂糖凝胶电泳结果（1，2，3-正常组腔鳞癌组织） total RNA1% agarose gel electrophoresis (14，5，6-OSCC)实验结果片杂交扫描结果nt Microarray Scanner 扫描杂交后的芯片，，强度较高，并且清晰，没有边缘化效应性对照点和阴性对照点相应有强、弱信号

表图,箱线图,荧光密度,值分布

图 3 荧光密度值分布箱线图Fig.3 Box-whisker plot of fluorescent density value火山图（Volcano plot）和分层聚类分析（Hierarchical）图中的 X 轴和 Y 轴分别表示差异倍数和 P 值，经归一的信号值分布在对应区域，灰点表示检测到的基因不符筛选标准。火山图结果说明存在很多显著差异表达的As。所谓的分层聚类分析，就是指根据不同样品间基因As)表达水平差别，把表达水平相近样品逐步分类聚集，似样品更容易聚类在一起，更直观呈现出样本间的关系个基因，每列表示一个样本。由图可以看出两组间的表图 4）。

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