富白细胞-血小板纤维蛋白对软组织愈合及炎症调节的研究

发布时间：2020-07-07 09:58

【摘要】：由于外伤、炎症、长期缺牙等原因,种植术区常常会遇到骨组织或软组织缺损的问题,需要进行各种种植外科手术,如引导骨再生、骨劈开、上颌窦底提升等,而软组织的良好愈合是种植外科手术成功的前提。良好的软组织愈合能够阻挡细菌侵入,为骨再生、种植体骨结合(osseointegration)提供良好的微环境;健康的牙龈袖口有助于获得良好及稳定的修复效果,因此,在种植手术后,软组织愈合质量的好坏,能否形成良好的生物学封闭,直接影响种植外科手术的成功与否。近年来,国内外学者为了加快软组织愈合速度,提高软组织愈合质量,做了大量的相关研究。临床上常采用局部软组织瓣处理、自体结缔组织游离瓣移植、自体黏膜游离瓣移植等方法关闭创面,但是,这些方法均会提升手术难度,造成“第二术区”,增加患者痛苦,且效果有限,易发生术后并发症。近年来,脱细胞真皮基质开始被应用于口腔黏膜的修复,但是,其仍具有价格昂贵、伦理学争议、疾病传播风险、创口局部免疫反应等问题。因此,学术界一直在寻找安全可靠、价格低廉、能够促进牙龈软组织再生、避免生物安全性风险且具有抗感染能力的生物材料,这种材料无疑具有巨大的临床价值。富白细胞-血小板纤维蛋白(Leukocyte-platelet-rich fibrin,L-PRF)是由Choukroun等人首次提取的。L-PRF作为一种富含血小板及多种生长因子的自体血小板浓缩物(platelet concentrates,PCs),制备简单,不需要添加任何抗凝剂及外源性凝血酶和胶凝剂,具有高效的促进组织再生能力,具有良好的临床应用潜力。因此,本研究拟探讨PRF对软组织愈合及炎症调节的影响,为促进口腔种植体周围软组织愈合提供理论依据。具体研究内容包括以下几个方面:1.人牙龈成纤维细胞的培养及体外炎症模型的建立。本研究利用组织块酶消化法培养人牙龈成纤维细胞,增殖迅速,细胞纯化效果好,成功率高,能够快速大量获得原代细胞。体外炎症模型的建立是后续研究的基础。本研究通过CCK-8法筛选牙龈卟啉单胞菌-脂多糖(Porphyromonas gingivalis-lipopolysaccharide,Pg-LPS)安全浓度,确定1μg/ml为Pg-LPS的安全浓度,不影响细胞的正常生长。然后利用实时qPCR确定Pg-LPS最佳刺激时间,实验结果显示:1μg/ml的Pg-LPS能够刺激成纤维细胞释放促炎因子,并在3h和6h后,达到释放峰值,以此作为后续实验的检测时间点。2.L-PRF的结构和生长因子的释放。本实验使用扫描电子显微镜观察L-PRF的超微结构,通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测L-PRF中转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、血小板衍生因子AA(Platelet derived growth factor-AA,PDGF-AA)和类胰岛素生长因子-1(insulin-like growth factors-1,IGF-1)的浓度。扫描电镜观察L-PRF具有富含高纤维蛋白的三维网络结构,在黄红交界处滞纳大量血小板和白细胞,同时至少在10天内持续释放组织愈合相关的生长因子(TGF-β1、PDGF-AA和IGF-1),具有一定的长效性,因此,我们认为,L-PRF在调节组织愈合方面具有很大的潜力。3.L-PRF对人成纤维细胞增殖的影响及对炎症的调节。本实验通过CCK-8(cell counting kit-8)检测了L-PRF对人牙龈成纤维细胞增殖能力的影响。通过显微镜观察L-PRF对衰老细胞增殖的影响,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测L-PRF对Pg-LPS刺激的成纤维细胞炎症因子释放的影响。CCK-8结果显示,100%、50%和25%的L-PRF条件培养基均可促进人牙龈成纤维细胞增殖,并且呈现一定的浓度依赖性。其中100%的L-PRF条件培养基促进增殖效果最明显。因而,选择100%的L-PRF条件培养液作为最佳浓度进行后续实验。显微镜观察L-PRF条件培养基培养衰老细胞结果显示,L-PRF能够恢复衰老的HGFCs细胞的生物学特性,促进衰老细胞增殖。ELISA结果显示用1□g/ml的Pg-LPS刺激人牙龈成纤维细胞6小时后,人牙龈成纤维细胞分泌的IL-1□,TNF-□,和IL-6显著升高,而令人惊讶的是,经L-PRF处理后,Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞分泌IL-1□,TNF-□,和IL-6受到了显著抑制。4.L-PRF参与炎症调节的体外研究。本实验建立了兔体内组织炎症模型,观察动物体重变化,创口愈合面积和组织苏木精和伊红染色评价L-PRF对口腔组织炎症的调节作用。本研究使用50%醋酸对口腔牙龈进行直接刺激,并在第4天引起了口腔炎症。醋酸处理后第4天口腔粘膜炎面积达到最大值。口腔溃疡形成后,第7天对照组的实验动物体重减轻,但于第14天又恢复。与之对比,L-PRF处理组的体重随时间增加,实验组和对照组在第7天和第14天体重差异显著。在第7天L-PRF治疗组的溃疡面积明显小于对照组,这意味着该组的愈合速度更快。第14天,L-PRF治疗组的粘膜溃疡明显缩小,且成为面积最小的组。HE染色镜下组织病理学检查,刺激前正常对照的标本上皮完整,无炎性细胞浸润。刺激后,在第7天,上皮层破坏明显,随后上皮层厚度发生改变,对照组的炎症细胞浸润更为严重。第7天,L-PRF治疗组开始了不完全的上皮再生,且愈合过程比对照组更快,表现为溃疡更小,炎症细胞浸润更少。第14天,治疗组基本恢复,再上皮化接近完成,创面愈合速度明显快于对照组。第21天,两组均完成再上皮化,L-PRF组的愈合明显完全。5.L-PRF对种植体周围组织愈合及术后炎症控制的影响:随机对照临床研究。本研究建立了一项前瞻性随机对照临床研究,以评估白细胞-血小板富纤维蛋白(L-PRF)对种植体周围组织反应的影响。本临床研究于2016年2月至2017年11月在吉林大学附属口腔医院进行,随机选取20例患者(男15例,女5例),平均年龄38岁(30-44岁),种植20颗植体。每组均有10个种植位点,其中I组为PRF组(试验组),II组为无PFR组(对照组)。通过术后疼痛评估,黏膜肿胀评估,创口愈合面积评估,术后种植体近远中骨高度和牙周袋深度变化测定,术后患者满意度调查几方面评价L-PRF对种植体周围组织愈合及术后炎症控制的影响。研究结果表明L-PRF能够显著减少术后疼痛和黏膜肿胀,加快创口愈合速度,骨水平增量和牙周健康都得到了保障,患者对整个种植修复过程感到满意。因此,这些病例显示了L-PRF促进种植体周围组织愈合的成功应用,为进一步临床应用提供了新的思路。综上所述,L-PRF对种植体周围组织愈合及炎症调节具有积极调节作用。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R783.6
【图文】：

组织修复,血小板,纤维蛋白

图 1.1 组织修复涉及的阶段的顺序说明1.1 富血小板纤维蛋白促进软组织愈合的研究进展1.1.1 概述目前，在开发能够调节炎症因子、提高组织愈合速度的生物添加剂方面，临床研究仍面临着重重困难。虽然早在 30 多年前就对纤维蛋白类物质的应用进行了解释[6]，但由于制备工艺复杂，且存在交叉感染的风险，其使用仍存在争议。随着血小板浓缩技术的发展以及制作方法的改进，富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)在 20 世纪 70 年代初首次被开发出来，并在 20 世纪80 年代开始流行[7-9]。第一代 PRP 是通过将收集到的血液与凝血酶和过量的钙混合，导致活化的血小板被固定在纤维蛋白网络中。PRP 的制备是通过二次离心得

纤维蛋白,生物活性分子,细胞类型,富集

PRP 可进一步促进软组织或硬组织的外科伤口愈合。Whitman 等人开发了商业化的 PRP[16]，他们是第一批尝试在口腔外科手术中应用 PRP 的研究者。在研究中他们发现，不论是在宿主骨还是在移植骨材料中，成骨细胞都有被激活的现象。然而，这个过程存在多种风险，使用牛凝血酶制备的 PRP，产生的相关抗体可能对患者造成潜在的生命危险，同时，抗凝因子的使用可能延迟伤口的正常愈合，这些问题使其应用受到限制。2000 年，法国科学家提出了新一代血小板浓缩物的概念，并将这种新产品命名为 L-PRF[5]。L-PRF 内富含大量的血小板，血小板内含有许多重要的生长因子，可促进细胞增殖、胶原生成、白细胞趋化、血管生成和细胞分化。同时，L-PRF 还富含大量的白细胞，这些白细胞在创口愈合过程起到重要作用[13, 18-22]。此外，L-PRF 含有增强骨改建的三种粘附分子(纤维蛋白、纤连蛋白和维甲酸)。抗凝剂的加入诱导了 PRP 的聚合，但 L-PRF 的聚合是一个自然而缓慢的过程。因此，L-PRF 具有更适合细胞因子和生长因子储存以及细胞迁移的纤维蛋白网络结构[23, 24]，如图 1.2。

成纤维细胞,伤口愈合,口腔,趋化因子

它们需要被“激活”，这意味着它们必须能够感知和响应外部刺激。直到最近 20 年，我们才意识到，成纤维细胞它还具有就监测结缔组织内环境平衡的重要作用，是机体内的 “前哨” 。成纤维细胞存在于许多组织中，是第一个对组织损伤或细菌感染起反应的细胞(图 1)。在急性创伤中，血液会渗漏进入组织间质，聚集的血小板释放生长因子和趋化因子，不仅会吸引免疫细胞，也会直接刺激此处的成纤维细胞产生和分泌更多的趋化因子,尤其 IL-6 和 IL-8，并在损伤部位召集中性粒细胞[67]。当感染时，脂多糖和其他细菌产物会再次诱导成纤维细胞产生 IL-6、IL-8 和其他趋化因子。一个在成纤维细胞和聚集的免疫细胞之间形成的复杂级联反应，主导了后续的炎症和组织修复。成纤维细胞表面上的CD40(TNF-α 受体家族的成员) ，和外来的免疫细胞表面的 CD40-L 之间形成了细胞的直接接触[68]。这些接触导致这两种类型细胞的相互激活：结果，成纤维细胞分泌更多的趋化因子，免疫细胞进一步释放炎症细胞因子，导致对损伤反应的放大 (图 1.3) 。

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