MTA调控人牙髓干细胞分化的分子机制的研究

发布时间：2020-07-09 18:32

【摘要】： 活髓保存治疗(包括盖髓术和切髓术)主要用于牙髓可复性损伤，是保证患牙健康的基础，其目的是维持牙髓-牙本质复合体的活力与功能，要使活髓保存治疗取得满意疗效，需要有良好的盖髓材料以便将牙髓与感染组织隔离，并为牙髓组织的自身修复提供良好的生物学环境。MTA作为盖髓剂可以有效隔绝外界刺激、保护牙髓，为牙髓修复提供适宜微环境，在诱导牙髓细胞的分化和预防感染、促进牙本质桥形成方面发挥重要作用。人牙髓干细胞(Human Dental Plup Stem Cells，hDPSCs)是存在于牙髓组织中未分化间充质细胞，具有多向分化潜能，可形成功能性的成牙本质细胞和牙本质。近年来MAPKs信号途径在细胞增殖和分化研究领域备受关注，作为一种进化保守性细胞间相互作用机制，MAPKs信号途径对多种细胞的增殖、分化和凋亡过程都有影响。 本课题在对人牙髓干细胞进行体外分离、培养和鉴定的基础上，应用MTT、Real-time PCR和Western blot等技术，研究MTA作用于人牙髓干细胞后，对细胞存活、增殖与分化的影响，进一步研究其对MAPKs各通路总蛋白和磷酸化蛋白的影响；并应用MAPKs抑制剂和MTA联合作用，特异性阻断各MAPKs通路，观察对MTA诱导人牙髓干细胞分化的影响。通过实验明确各MAPKs通路在MTA促进人牙髓干细胞中分化标记基因表达增高中的具体调节作用，为进一步研究牙髓损伤修复过程中MTA促进人牙髓干细胞分化过程中的分子机制提供理论基础。 本研究共分为三个部分： 第一部分：MTA对人牙髓干细胞增殖和分化的影响 目的体外培养hDPSCs，观察MTA对体外培养的hDPSCs的存活、增殖和分化的影响。 材料和方法取正常19-25岁成人第三磨牙牙髓，体外分离克隆培养hDPSCs并鉴定；不同浓度MTA作用于hDPSCs不同时间后，通过MTT和Real-time PCR技术检测MTA对hDPSC存活和增殖的影响，以及ALP、DSPP、BSP、OCN和COLImRNA表达的变化。 结果通过倒置显微镜下细胞形态学检查，以及免疫组织化学染色证明所培养细胞是hDPSCs；高浓度MTA(20mg/ml和10mg/ml)明显减低细胞的存活率，低浓度MTA (2mg/ml及以下)对细胞无毒性，促进hDPSCs的增殖，并且能引起ALP、DSPP、BSP、OCN和COLI基因的mRNA表达增高。 结论成功分离和培养了hDPSCs，MTA能够促进hDPSCs的增殖和分化。 第二部分：MTA对人牙髓干细胞中MAPKs信号通路蛋白表达的影响 目的观察MTA单独作用及与MAPKs抑制剂联合作用hDPSCs后，细胞中MAPKs各条通路蛋白表达的影响。 材料和方法将hDPSCs随机分为空白对照组和MTA作用不同时间组，利用Western blot方法检测MTA作用后，hDPSCs中ERK1/2、JNK1/2和p38总蛋白和活性蛋白(磷酸化蛋白)的表达；再将hDPSCs随机分为空白对照组、MTA阳性对照组和MTA与MAPKs抑制剂共同作用组，Western blot检测MTA和MAPKs通路抑制剂联合应用后，hDPSCs中三条通路总蛋白和磷酸化蛋白的表达。 结果在MTA作用下，加抑制剂前后，与对照组比较，2h内hDPSCs中各MAPKs通路总蛋白没有明显变化；而各磷酸化蛋白则发生了明显变化。在加抑制剂前，MTA作用15min后phos-ERK、phos-JNK、phos-p38表达明显增高；而加入抑制剂后，各通路特异性抑制剂ERK(U0126)、p38(SB203580)、JNK(SP600125)明显降低了本通路磷酸化蛋白的表达。各组与对照组比较差异有统计学意义。 结论MTA不能引起MAPKs通路总蛋白的变化，却能明显促进磷酸化蛋白的增高；MAPKs抑制剂能够特异性抑制本通路MTA作用后磷酸化蛋白的表达。 第三部分：MAPKMAPKs通路在MTA诱导人牙髓干细胞分化过程中的作用 目的应用MAPKs阻滞剂与MTA共同作用hDPSCs后，观察ALP、DSPP、BSP、OCN和COLI的变化，明确各条通路在hDPSCs表达分化相关基因中的作用。 材料和方法将hDPSCs随机分为空白对照组、阳性对照组和实验组，各通路抑制剂作用1h后，加入MTA作用12h，采用Real-time PCR法检测ALP、DSPP、BSP、OCN和COLImRNA的变化。 结果与阳性对照组相比，加入U0126后，各基因的表达明显下降，差异具有统计学意义；而加入SB203580和SP600125后，各基因的mRNA表达无明显变化，差异无统计学意义。 结论在MTA促进hDPSCs分化标记基因表达增高中，ERK通路起主要作用，而JNK和p38通路可能没有参与此过程。 总之，本研究发现MTA可促进hDPSCs的增殖和分化，并且能够激活MAPKs通路，使hDPSCs中MAPKs磷酸化蛋白表达增高，其中ERK MAPK途径可能参与了MTA促使hDPSCs向成牙本质样细胞的分化。这一研究成果，为揭示MTA促进hDPSCs向成牙本质样细胞分化的分子机理以及探索新的牙髓炎症治疗方法提供了实验依据。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R781.3
【图文】：

2 8图 1 E R K MA P K 信号 转 导 途 径 （摘 自 C el l S ig n a li n g Te c hn o l o g y we b s i t e ： H tt p : // w w w . ce l l s i g n al . c om ） S H2 结构 域 的 底 物 发 生 活 化 。 生长 因 子 结 合 蛋 白 2 (G r b 2 ) 作为 接 头 分 子 ，与 激活 的受 体 酪氨 酸 蛋 白激 酶 和 鸟 苷酸 释 放 因子 ( G R Fs ) 结合 ，通 过 G R Fs 的作 用， R as 开始 释 放G D P ，与 G T P 结合 成为 活 化态 ，然 后 与 G D P -G T P 活化 因 子 S OS (s o n of s ev e n l es s ) C 端 中 富 于 脯 氨 酸 的 序 列 相 互 结 合 形 成 受 体 -G r b 2 - S OS 复 合 物 。S OS 与 R as -G D P 结合 ，使 G T P 取代 R as -G D P ，进 而R as 由 失活 态

3 0图 2 p3 8 MA P K 信号 转 导 途 径 （摘 自 C el l S ig n a li n g Te c hn o l o g y we b s i t e ： H tt p : // w w w . ce l l s i g n al . c om ） IL -1 β 、 TN F - α 、 IL -6 的 产 生 ， 诱 导 型 一 氧 化 氮 合 酶 （ i nd u ci b l e ni t ri c ox i de s yn t ha s e， i NO S ）的 表 达 、C OX - 2 的诱 导以 及 血 管细 胞 粘附 分 子 （1 va s cu l a rc e l lad h es i on m ol ec u l e- 1 ，V C AM -1 ） 的 诱 导 等均 起 着关 键 性作 用 。p 3 8M AP K 的激活 主要 见 于炎 症 反 应， 可 因 炎 症刺 激 如 IL -1 、T N F 、 L P S 、缺 血 再灌 注 等 诱导 内 源 性 免 疫 细 胞 如 单 核 细 胞 、 内 皮 细 胞 和 中 性 粒 细 胞 内 p3 8 M AP K 的激 活 ， 而 p3 8 M AP K 的 激 活 对 于 上 述 细 胞 内 炎 症 表 型 的 表 达 是 关 键 性 的 。

第 四军 医大 学 博士 学 位论 文 已有 研 究 证实 ， 许 多细 胞 因 子、 转 录 因子 和 细 胞表 面 受 体的 表 达 均受 到 了 p3 8 的调 控 [ 96 ]。3. 1 . 3 JN K 信号 通路 06期 赵秀：MTA调控人牙髓干细胞分化的分子机制的研究 E074-7-2

【引证文献】

相关期刊论文 前1条

1 丁芳;吴家媛;贾谦;刘丽;易国梅;;TGF-β1对人根尖牙乳头干细胞增殖和分化的影响[J];牙体牙髓牙周病学杂志;2011年07期

本文编号：2747832