雌激素缺乏对大鼠牙髓干细胞增殖、定向分化的影响及机制研究

发布时间：2020-07-11 20:10

【摘要】：雌激素是人体重要的性激素，研究表明雌激素可以调节间充质干细胞的增殖及分化能力，如雌激素缺乏状态的大鼠骨髓间充质干细胞（rat bone marrowmeschymal stem cells，rBMMSCs）、牙周膜干细胞（periodontal ligament stemcells，PDLSCs）增殖能力及成骨能力下降，相反，经雌激素刺激后，大鼠骨髓间充质干细胞成骨能力升高。目前，雌激素对牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)的成牙及成骨能力影响尚未有文献报道。第一部分雌激素缺乏大鼠模型的建立及细胞增殖能力检测研究目的：建立雌激素缺乏大鼠模型，分离培养牙髓干细胞，检测其增殖能力。研究方法：30只八周龄雌性SD大鼠，随机分为假手术组（Sham）及卵巢去势组（OVX）。手术后一个月，分离两组大鼠上下颌切牙及牙髓，酶消化法及有限稀释法分离培养多克隆来源的牙髓干细胞，α-MEM培养,细胞角蛋白（CK）、波形丝蛋白(Vimentin)和Stro-1免疫细胞化学染色验证其间质干细胞特性。采用四甲基偶氮噻唑盐（MTT）法绘制两组细胞生长曲线，流式细胞术（FCM）检测细胞周期分布，计算细胞增殖指数（PI），检测雌激素缺乏对DPSCs增殖能力的影响。实验结果：OVX组大鼠体重较Sham组显著增加，体内雌激素水平较Sham组降低，差异有统计学意义(P 0.05)。两组细胞呈CK染色阴性，Vimentin，Stro-1染色阳性。MTT及FCM结果显示Sham-DPSCs及OVX-DPSCs增殖能力没有显著差异。结论：卵巢去势一个月，可成功建立雌激素缺乏大鼠模型。经鉴定，分离出的多克隆牙髓细胞为间充质来源干细胞，雌激素缺乏状态对其增殖能力没有显著影响。第二部分雌激素缺乏对大鼠牙髓干细胞成牙、成骨向分化能力的影响研究目的：明确雌激素缺乏对大鼠牙髓干细胞成牙/成骨向分化能力的影响。研究方法：检测两组细胞在常规培养液及成骨诱导液中培养3天时碱性磷酸酶（ALP）活性，茜素红染色检测成骨诱导液诱导两组细胞14天时的钙结节形成情况，提取两组细胞总RNA和总蛋白，实时定量逆转录聚合酶链式反应实验（Real-time RT-PCR）检测牙向/骨向分化相关基因（Alp、Runx2、Ocn、Osx和Dspp等）的表达情况，蛋白免疫印迹实验（Western blot）检测牙向/骨向分化相关蛋白（RUNX2、OSX、OCN、DSP等）的表达情况。将细胞团体内移植后，通过苏木素伊红染色及免疫组织化学染色检测分析体内形成的移植物，通过以上实验来评价雌激素缺乏状态下大鼠牙髓干细胞的成牙/成骨向分化能力。实验结果：在成骨培养液条件下，OVX-DPSCs的ALP活性、矿化结节形成量均较Sham-DPSCs少，差异具有统计学意义（P 0.05），OVX-DPSCs成牙/成骨向分化标志基因及蛋白表达（Alp、Runx2/RUNX2、Osx/OSX、Ocn/OCN和Dspp/DSP）均较Sham-DPSCs低，差异具有统计学意义（P 0.05）。体内移植物免疫组化结果显示OVX-DPSCs成牙（DSP）、成骨(OCN)标志蛋白表达均较Sham-DPSCs弱。结论：与正常大鼠DPSCs相比，雌激素缺乏状态下的DPSCs成牙、成骨能力明显下调。第三部分雌激素缺乏调控DPSCs分化的NF-κB通路机制研究研究目的：探讨核因子κB（NF-κB）通路在雌激素缺乏调控DPSCs分化过程中的可能作用。研究方法：酶联免疫分析法（ELISA）检测两种细胞培养上清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）的浓度，提取第三代Sham-DPSCs及OVX-DPSCs的胞蛋白及核蛋白，检测NF-κB通路相关蛋白（IκBα、P-IκBα、P65、P-P65）的表达情况，检测NF-κB通路抑制剂（BMS345541）对OVX-DPSCs的ALP活性、成牙成骨向分化（Alp、Runx2/RUNX2、Osx/OSX、Dspp/DSP）基因及蛋白的影响。研究结果：OVX-DPSCs上清中TNF-α浓度较Sham-DPSCs高（P 0.05），OVX-DPSCs胞浆中P-IκBα、P-P65表达较Sham-DPSCs高，且胞核中P65表达也较Sham-DPSCs高。经BMS345541刺激后，OVX-DPSCs的ALP活性，成牙成骨向分化相关（Alp、Runx2/RUNX2、Osx/OSX、Dspp/DSP）基因及蛋白的表达均显著上升，差异具有统计学意义（P 0.05）。结论：NF-κB通路在雌激素缺乏调控DPSCs分化过程中发挥重要作用， NF-κB通路抑制剂可以部分缓解或纠正由雌激素缺乏引起的DPSCs分化能力下降的问题。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R78
【图文】：

雌二醇,卵巢去势,体重

图 1.1 两组大鼠血清雌二醇检测及体重（A）卵巢去势一个月，大鼠血清雌二醇明显降低（P < 0.01）。（B）卵巢去势一个月后，OVX 组大鼠体重较 Sham 组重（P < 0.01）。2.2 细胞培养两组细胞在镜下均为贴壁生长，形态较为均一，呈梭形、纺锤形，生长呈旋涡状、纤维样或放射状，成纤维细胞样结构，极性排布。两组细胞形态无明显差异（图 1.2）。

细胞形态,显微镜下,卵巢去势,雌二醇

细胞化学染色,阴性,细胞,干细胞

抗 Stro-1 免疫细胞化学染色为阳性（图1.3C，G），PBS 组为阴性对照（图 1.3D，F），验证其间质干细胞特性。图 1.3 两组细胞抗 CK，Vimentin 及 Stro-1 细胞化学染色（A） Sham-DPSCs 抗 CK 染色阴性；（B） Sham-DPSCs 抗 Vimentin 染色阳性；（C）Sham-DPSCs 抗 Stro-1 染色阳性；（D）PBS 组为阴性对照；（E）OVX-DPSCs抗 CK 染色阴性；（F）OVX-DPSCs 抗 Vimentin 染色阳性；（G）OVX-DPSCs抗 Stro-1 染色阳性；（H）PBS 组为阴性对照，400 倍镜下，标尺为 100μm。2.4 两组细胞 MTT 生长曲线MTT 绘制两组细胞生长曲线发现

【参考文献】