仿生肽引导纳米无定形磷酸钙再矿化脱矿牙釉质

发布时间：2020-07-16 20:11

【摘要】：目的:龋病是目前世界上发病率最高的口腔疾病之一。龋病的进程根据其入侵牙体组织的深度分为浅、中、深龋。而对于已经形成龋洞的牙体而言,牙体硬组织尚未发现任何可以再生的手段,因此目前仅有的治疗方法就是通过机械性或者化学性的方法预备去除掉已经龋坏组织,并在牙体组织上磨除一定量的健康组织预备充填洞型,随后代之以修复材料充填,这种治疗方法会导致牙体组织过多丧失,剩余的冠部牙体组织更容易折断。这一现状提醒我们,预防中、深龋的形成,治疗早期尚未形成龋洞的患牙是口腔预防的重要任务,这也符合微创牙科学(Minimally Invasive Dentistry,MID)的原则。在牙体硬组织尚未形成实质缺损而仅存在脱矿的条件下最大限度地发挥牙体自身的愈合潜能,阻断龋病进展,修复缺失的牙体结构和功能是牙体牙髓临床需要追求的目标之一。牙齿再矿化是微创牙科的重要治疗技术之一。牙釉质再矿化,对于临床预防和治疗如正畸后的白垩龋等釉质早期龋坏具有极高价值。如果能够利用脱矿牙釉质表面尚未发生损坏的牙体硬组织结构进一步仿生再矿化出与天然牙釉质相近的结构组织,对于保留整个牙体而言起着至关重要的作用,这一思路也被称作仿生矿化。但现有的再矿化方法操作均比较困难,难以满足临床上对于操作时间简便快捷以及特异性连接在牙釉质表面等基本需求,且再矿化的作用结果与天然牙釉质表征相去甚远。在牙体发育过程中,釉原蛋白对于牙釉质的形成起主要作用。其具有诱导无定形磷酸钙颗粒定向有序沿C轴排列并在降解后促进无定形磷酸钙向羟基磷灰石转化的能力。实验证明在缺乏了釉原蛋白中关键序列的大鼠中,均出现了肉眼可见的明显牙釉质形成缺陷症。本研究创新性地合成了一条诱导合成仿生多肽序列,其组成包括了釉原蛋白的关键序列和特异性羟基磷灰石连接序列。旨在提供一个通过仿生多肽引导的快速仿生再矿化牙釉质龋模型的再矿化方法,通过体外牙体组织实验验证合成的仿生多肽对于无定形磷酸钙颗粒的诱导排列能力以及在牙表面再矿化的能力。进而为以后投入临床牙釉质再矿化才做提供一定参考。方法:本实验选取了10颗正畸前要求拔除的尚未完全萌出的埋伏阻生齿,要求阻生齿完整拔除。将每颗牙体的从轴面四个方向(颊侧、舌侧、近中、远中)使用金刚砂磨头均匀切割下4片厚度一致的釉质片。每颗牙的4个釉质片随机分配到A、B、C、D四个组中。A组、B组、C组均使用37%磷酸进行牙釉质表面酸蚀30s模仿脱矿后的牙齿表面以及临床操作,D组作为天然牙对照组不做酸蚀处理。随后B组使用经次氯酸钠(Na Cl O)处理的羧甲基壳聚糖/无定形磷酸钙(CMC/ACP)再矿化牙体表面,而C组中加入仿生多肽引导的经Na Cl O处理的CMC/ACP基于模仿釉原蛋白对ACP的生物矿化的影响。实验结果从透射电镜(TEM)/扫描电镜(SEM)/激光共聚焦显微镜(CLASM)/X射线衍射(XRD)/纳米压痕试验(nano-indentation)表征矿化后的牙体硬组织结果。结果:1、CMC可以稳定高浓度过饱和的ACP,形成CMC/ACP纳米复合物。2、在人工釉质龋模型中,Na Cl O快速降解CMC/ACP纳米复合物以模拟基质金属蛋白酶(MMP-20)和激肽释放酶(KLK4)等釉原蛋白降解酶的作用,并在仿生多肽诱导下,使得纳米颗粒快速而特异性的在釉质表面形成再矿化。3、再矿化得到的牙釉质表面机械性能(硬度及弹性模量)与天然牙釉质类似。结论:这种新型合成仿生多肽能够促进ACP快速向HAP晶体转化并特异性的连接在缺损釉质表面,形成的仿生HAP结构和机械强度与天然牙釉质晶体类似,临床上可以进一步用于白垩龋的直接快速治疗和预防,并符合微创口腔医学的要求。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R788.1
【图文】：

合成多肽,软件预测,序列

XRD 特征峰比率、马尔文粒径分布统计、经由纳米压痕实验所得到的样品表面弹性模量和硬度值的统计均使用 one-wayANOVA 评估 95%置信区间。进行了 95%置信水平的多范围检验（采用 Fisher 的最小显著性差异（LSD）程序），以确定统计上群体的同质性。对于机械测试，student’t 检验用于确认酸蚀后、天然牙以及再矿化组之间硬度和弹性模量的差异。1.3 结果1.3.1 多肽二级结构预测利用在线软件 PSIPRED 预测 PA 的二级结构，预测结果如图 1 所示。PA 有三个部分构成，包括 CT-16 序列、HA6-1 序列以及期间的 GGGGS 柔性连接体。这两个功能序列分别是诱导序列和结合序列。经过对其序列的基本性质和二级结构预测可知，该合成多肽序列极易溶于水，等电点位于 pH=6.58 处。二级结构中 CT-16 序列发生螺旋，与釉原蛋白中 C 末端表现一致。并且二级结构中并未表现出多肽序列中的彼此影响，三段结构均可完整存在，未发生序列之间的螺旋或者折叠结构。这一结果为多肽序列发挥各自功能奠定了基础。

马尔文,直径分布,纳米颗粒,激光

11图 3：马尔文激光颗粒计数仪计数纳米颗粒直径分布图。1.3.3 再矿化后纳米压痕及机械性能比较结果从纳米压痕检测得到的负载曲线如图 4 所示。在相同的载荷力（100mN）作用下，不同组釉质表面的位移深度存在明显差异。A 组表现出最深的位移（图4 中的黑色曲线）。相比之下，B 组和 C 组（分别为橙色和蓝色线）的位移深度相比于 A 组有了明显的回复。C 组的再矿化结果表面合成多肽组的釉质的力学性能恢复程度最高。与天然牙釉质组（粉红线）最为接近。根据纳米压痕检测得到了全部样本表面的弹性模量和硬度值。其统计结果分别记录在表 1 中。脱矿处理后各组的弹性模量和硬度值均显著降低（p＜0.001）。而 C 组经由合成多肽引导的经 NaClO 处理的 CMC/ACP 组显出出与天然牙釉质相近的（P > 0.05）弹性模量和硬度，表现出本实验再矿化方法对于脱

负载曲线,纳米压痕,负载曲线,釉质

不同组釉质表面的位移深度存在明显差异。A 组表现出最深的位移（图4 中的黑色曲线）。相比之下，B 组和 C 组（分别为橙色和蓝色线）的位移深度相比于 A 组有了明显的回复。C 组的再矿化结果表面合成多肽组的釉质的力学性能恢复程度最高。与天然牙釉质组（粉红线）最为接近。根据纳米压痕检测得到了全部样本表面的弹性模量和硬度值。其统计结果分别记录在表 1 中。脱矿处理后各组的弹性模量和硬度值均显著降低（p＜0.001）。而 C 组经由合成多肽引导的经 NaClO 处理的 CMC/ACP 组显出出与天然牙釉质相近的（P > 0.05）弹性模量和硬度，表现出本实验再矿化方法对于脱

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